Das grün fluoreszierende Protein (GFP)

Transkript

1 Datum Arbeitsplan S1 Belehrung, kompetente E. coli Zellen herstellen, PCR GFP Gelelektrophorese GFP, Vortrag, Gel-Aufreinigung, Konzentrationsbestimmung Reformationstag Vektorverdau und Dephosphorylierung, PCR-Fragment-Verdau, Gel Vektorverdau, Reinigung Vektor und PCR-Fragment, Konzentrationsbestimmung DNA-Extraktion (3 h), Konzentrationsmessung, Restriktionsverdau Fällung Restriktionsverdau, PCR Southern Sonde und Gelelektrophorese Southern Gel, Ligation und Transformation von E. coli, Platten gießen, Southern Blot 6h Kolonie-PCR, Agarosegelelektrophorese, Flüssigkulturen animpfen, Prehyb und Hyb Southern Signaldetektion Southern Plasmidisolation, Konzentrationsmessung, Test-Verdau, Agarosegelelektrophorese, Mutagenese-PCR Agarosegelelektrophorese, DpnI Verdau, Transformation von E. coli; Platten-gießen Nachweis von GFP, Protein-Expression, Mikroskop Zellaufschluss, His-Tag Reinigung Proteingel gießen, Proteingel, Bradford Proteinbestimmung, (Stabilitätsuntersuchung) Testat und Protokollabgabe Das grün fluoreszierende Protein (GFP) Eines der wichtigsten Werkzeuge in der Zellbiologie ist das Green Fluorescent Protein (GFP). Dieses aus der Qualle Aequorea victoria stammende, grün fluoreszierende Protein wurde 1961 von Osamu Shimomura beschrieben. Bei Anregung mit blauem (oder UV-Licht) fluoresziert dieses Protein grün. Seine enorme Bedeutung liegt in der Möglichkeit, Zellen und sogar ganze Organismen mit diesem GFP-Gen zu transformieren. Dazu wird das GFP-Gen alleine oder mit beliebigen anderen Proteinen Gen-spezifisch fusioniert in die Zelle eingeschleust. Die Zelle produziert nun entweder das GFP alleine oder gemeinsam mit der Synthese des gekoppelten Proteins. Für die Entdeckung und Entwicklung des grün fluoreszierenden Proteins erhielten Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Y. Tsien 2008 den Nobelpreis für Chemie. Abbildung 1 Aequorea victoria ( GFP ist ein relativ kleines Protein bestehend aus 238 Aminosäuren (26,9 kda), welches aus einer α-helix und 11 antiparallelen β-faltblättern besteht, die eine zylinderartige Struktur ausbilden ( ß-can ). Die α-helix im Zentrum des Zylinders enthält das Fluorophor, welches durch seine abgeschirmte Lage im Inneren des Zylinders geschützt ist. Der Fluorophor wird bei der Faltung des Proteins autokatalytisch aus der Aminosäuresequenz Ser 65 - Tyr 66 -Gly 67 durch Cyclisierung und Oxidation gebildet und ist somit kovalent in der Proteinstruktur verankert.

2 Abbildung 2 Struktur von GFP. A: GFP besitzt eine zylinderartige Struktur, die aus einer α-helix und 11 antiparallelen β- Faltblättern besteht. B: Das Chromophor befindet sich in der α-helix, welches von den ß-Faltblättern umgeben ist. Dabei befinden sich die am Aufbau des Chromophors beteiligten Aminosäuren im Zentrum des Zylinders. (nach C: Bildung des Chromophors aus drei benachbarten Aminosäuren (Serin (65), Tyrosin (66) und Glycin (67) Das autofluoreszierende Protein GFP kann in einer Vielzahl von Organismen, wie Bakterien, Hefen, Drosophilia, C. elegans, Zebrafisch, Xenopus oder auch verschiedenen Säugetier und Pflanzenzellen expremiert werden. Dabei kann es leicht in Zellen und Organellen nachgewiesen werden und dient vor allem als Reporter, um Genexpression und Proteinlokalisation nachzuweisen sowie um bestimmte Zellorganellen zu markieren. Literatur Tsien (1998); The green fluorescent protein, Annu Rev Biochem Ehrig et al. (1995); Green-fluorescent protein mutants with altered fluorescence excitation spectra, FEBBS Letters Ckurshumova et al. (2011); Glow in the Dark: Fluorescent Proteins as Cell and Tissue-Specific Markers in Plants, Molecular Plant

3 Ziele des Praktikums Anhand des Proteins GFP sollen die Techniken der Klonierung eines Zielproteins bis hin zur Expression und Reinigung experimentell erarbeitet werden. Folgende Methoden werden dabei unter anderem Anwendung finden: - PCR-/ Mutagenesetechniken - Restriktionsverdau und Analyse - Klonierung von DNA-Fragmenten in einen Vektor - Gelelektrophoresetechniken - Transformation von E. coli - Anzucht rekombinanter Mikroorganismen/heterologe Genexpression - Proteinreinigung und Konzentrationsbestimmung Aufbau des Praktikumteils GFP 1) Klonierung von GFP in einen Expressionvektor mit Histag a. Herstellung chemisch kompetenter E. coli b. PCR mit Primern, die Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthalten c. Aufreinigung des PCR Produktes mittel Gelextraktion d. Restriktionsverdau und Dephosphorylierung vom Vektor e. Restriktionsverdau vom PCR Produkt f. Aufreinigung Vektor und PCR Produkt nach Restriktionsverdau g. Ligation von Vektor und PCR-Produkt h. Transformation von E. coli mit Ligationsprodukt i. Kontrolle der Klonierung mittels Kolonie-PCR j. DNA-Miniprep k. Kontrolle der Klonierung mittels Restriktionsanalyse 2) Funktionelle Analyse des GFP mittels Mutagenese-PCR a. Mutagenese-PCR b. DpnI Restriktionsverdau c. Transformation von E. coli mit PCR-Produkt d. Analyse der hergestellten Protein-Varianten 3) Heterologe Genexpression und Proteinreinigung mittels Histag a. Proteinexpression mittels IPTG b. Zellaufschluss c. Proteinreinigung mit HisTag d. SDS-Gelelektrophorese e. Bradford Proteinbestimmung Protokoll Am Ende des Praktikums ( ) soll von jeder Praktikumsgruppe ein Protokoll zu diesem Versuchsblock abgegeben werden. Dieses sollte folgendermaßen aufgebaut sein: 1. Name, Datum, Gruppe, 2. Studiengang, Matrikelnummer 3. Kurze Einleitung (5-10 Sätze) zu den einzelnen Versuchsteilen 4. Material und Methoden (nur falls abweichend vom Skript!!)

4 5. Ergebnisse (Messwerte in Form von Tabellen; Auswertung, mathematisch, graphisch; Abbildungen selbsterklärend beschriftet) 6. Diskussion (Bewertung der Ergebnisse, Vergleich mit Literaturdaten (sofern vorhanden) bzw. mit zu erwartenden Ergebnissen, Fehlerbetrachtung)

5 Methodenprotokolle 1) Klonierung von GFP in einen Expressionvektor mit Histag Grundlegende, immer wiederkehrende Methoden der Molekularbiologie sind die molekulare Klonierung, die Überproduktion und Reinigung von Proteinen. In diesem Praktikum soll das Protein GFP aus dem Vektor pet_mini, einem einfachen Klonierungsvektor, in einen Expressionsvektor mit HisTag kloniert werden. Abbildung 3 Klonierungsstrategie für das GFP-Gen in den Vector ptrchis_a 1 a) Herstellung chemisch kompetenter E. coli Zentraler Punkt jedes Klonierungsexperiments ist die Einführung von rekombinanter Plasmid-DNA in Bakterienzellen durch den Vorgang der Transformation. E. coli besitzt keine natürliche Transformationskompetenz und muss durch chemische oder physikalische Methoden künstlich kompetent gemacht werden. 1) Animpfen von 3 ml LB-Medium mit einem Klon von E. coli DH5α 2) Kultur über Nacht bei 37 C und 190 rpm schütteln 3) 50 ml LB-Medium werden mit 1 ml der Übernachtkultur angeimpft (in 200-ml-Kolben) 4) Schütteln ca. 2-3 h bei 37 C bis ein OD 600 von 0,5 bis 0,8 erreicht ist (jede halbe Stunde OD 600 messen!!!) 5) Kultur für 10 min bei 1118 g (5000 rpm) bei 4 C zentrifugieren 6) Pellet in 5 ml eiskaltem 50 mm CaCl 2 resuspendieren

6 7) 10-minütiges Zentrifugieren der Kultur bei 1118 g (5000 rpm) bei 4 C 8) resuspendieren des Pellets in 20 ml eiskaltem 50 mm CaCl 2 9) 30 min aus Eis inkubieren 10) Kultur für 10 min bei 1118 g (5000 g) bei 4 C zentrifugieren 11) resuspendieren des Pellets in 2 ml eiskaltem 50 mm CaCl 2 12) 15 min auf Eis inkubieren 13) 300 µl 86 % Glycerin dazugeben 14) aliquotieren der Zellen (100 µl/eppi) und sofortiges Einfrieren in flüssigem Stickstoff 15) bei 80 C bis zur Transformation lagern A) Wodurch erlangen die Zellen die Fähigkeit zur Aufnahme von DNA, bzw. wie wirkt CaCl 2? 1 b) PCR mit Primern, die Schnittstellen für Restriktionsenzyme enthalten Zur Klonierung eines Gens, wird in einen ersten Schritt das Gen mittels spezifischer Primer amplifiziert. Diese Primer enthalten zusätzlich an ihrem 5 Ende Erkennungssequenzen für die benötigten Restriktionsenzyme BglII und EcoRI. Reagenzien: 10 x PCR buffer (segenetic B with MgCl 2 ) dntps (2 mm each) primer forward (GFP_fwd_BglII) 5 µm primer reverse (GFP_rv_ EcoRI) 5 µm DNA template (plasmid DNA 1:50 verdünnt ( Taq Polymerase (1 U/µl) ng/µl)) Um genug PCR Produkt zu bekommen, setzt jede Gruppe 2 PCR Reaktionen an! PCR Wasser up to 50 µl 1 x PCR buffer dntps (200 µm each) Primer forward (0.5 µm) Primer reverse (0.5 µm) 0.5 µl Template DNA 1 U Taq Polymerase mischen, kurz zentrifugieren PCR Programm: 95 C 5 Minuten 30 Zyklen: 95 C 45 sec; 55 C 45 sec; 72 C 45 sec 72 C 10 Minuten Die PCR Reaktionen mit Ladepuffer versehen und auf ein 1% Agarosegel auftragen

7 A) Wie funktioniert eine PCR? B) Wie läuft DNA im Agarosegel und warum? 1 c) Aufreinigung des PCR Produktes mittels Gelextraktion Nach der PCR wird zur Analyse das Reaktionsprodukt auf einem Gel analysiert. Zum Entfernen von Nebenprodukten der PCR, und zum Entfernen der Primer, Polymerase und zum Pufferwechsel führt man eine Reinigung mittels Gelextraktion durch. 1) Excise the DNA fragment from the agarose gel with a clean, sharp scalpel. Cut the smallest possible gel slice!!! Place the gel slice into a 2 ml tube and weigh the gel slice using an empty tube as reference. 2) Add 300 µl binding buffer for every 100 mg agarose gel. 3) Incubate at 56 C for 10 min (or until the gel slice has completely dissolved). To help dissolve gel, mix by vortexing the tube every 2 3 min during the incubation 4) Add 150 µl isopropanol for every 100 mg agarose gel to the sample and mix by vortexing. 5) Place one High Pure Filter Tube into one collection tube. 6) To bind DNA, pipette the sample into the upper reservoir of the Filter Tube. If the volume of gel suspension is over 700 µl, simply load and spin again. 7) Centrifuge for 30 sec at full speed. 8) Remove the Filter Tube from the collection tube. Discard flow-through and place the Filter tube back in the same collection tube. 9) To wash, add 500 µl Wash Buffer and centrifuge for 30 sec. 10) Discard the flow-through and add 200 µl Wash Buffer, centrifuge for 30 sec. 11) Place the filter tube into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. 12) To elute DNA, add 50 μl ddh 2 O to the center of the Filter tube membrane, let the column stand for 1 min and centrifuge the column for 30 sec. DNA Konzentrationsbestimmung - 1 µl DNA zusammen mit 49 µl ddh 2 O in ein 1,5 ml tube geben - Gut mischen und alles in eine Küvette pipettieren - Photometrische Konzentrationsbestimmung mit ddh 2 O als blank A) Wie funktioniert die Reinigung der DNA mittels Silicamenbransäulchen? B) Worauf beruht die Konzentrationsbestimmung der DNA im Photometer?

8 1 d) Restriktionsverdau und Dephosphorylierung vom Vektor Zur Klonierung erfolgt nun ein Restriktionsverdau von Vektor und Plasmid mit BglII und EcoRI. Zusätzlich wird der Vektor an den von den Restriktionsenzymen geöffneten Enden noch dephosphoryliert. 1) Prepare the following reaction mixture containing: Plasmid DNA (ptrchis_a 140 ng/µl) 1 µg 10x FastDigest Buffer 2 µl FastDigest Restriction Enzyme BglII 1 µl FastDigest Restriction Enzyme EcoRI 1 µl FastAP Thermosensitive Alkaline Phosphatase 1 µl ddh 2 O up to 20 µl 2) Mix thoroughly, spin briefly and incubate at 37 C for 20 min. 3) Stop reactions by heating at 80 C for 20 min. 4) Preparing of a 1% agarose gel 5) For the gel use 1 µl of digested vector DNA, dilute in 9 µl ddh2o, add 3µl DNA loading dye; as a control load 200 ng (x µl) undigested plasmid DNA A) Warum wird der Vektor dephosphoryliert? 1 e) Restriktionsverdau vom PCR Produkt 1) Prepare the following reaction mixture containing: 10x FastDigest Buffer 2 µl FastDigest Restriction Enzyme BglII 1 µl FastDigest Restriction Enzyme EcoRI 1 µl PCR product (~ ng) x µl ddh 2 O up to 20 µl 1) Mix gently, spin briefly and incubate at 37 C for 30 min. 2) Stop reactions by heating at 80 C for 5 min. A) Warum erfolgt die Klonierung mit zwei verschiedenen Restriktionsenzymen?

9 1 f) Aufreinigung Vektor und PCR Produkt nach Restriktionsverdau Zum Stopp des Restriktionsverdaus von BglII, zum Entfernen der Enzyme und zum Pufferwechsel führt man eine Reinigung der Reaktionsansätze mittels DNA-bindender Silicasäulchen durch. 1) Adjust the volume of the DNA sample to be purified to 100 µl 2) Add 500 µl Binding Buffer to the DNA sample and mix well. 3) Place one High Pure Filter Tube into one collection tube. 4) To bind DNA, pipette the sample into the upper reservoir of the Filter Tube. 5) Centrifuge for 30 sec at full speed. 6) Remove the Filter Tube from the collection tube. Discard flow-through and place the Filter tube back in the same collection tube. 7) To wash, add 500 µl Wash Buffer and centrifuge for 30 sec. 8) Discard the flow-through and add 200 µl Wash Buffer, centrifuge for 30 sec. 9) Place the filter tube into a clean 1.5 ml microcentrifuge tube. 10) To elute DNA, add 50 μl ddh 2 O to the center of the Filter tube membrane, let the column stand for 1 min and centrifuge the column for 30 sec. DNA Konzentrationsbestimmung - 1 µl DNA zusammen mit 49 µl ddh 2 O in ein 1,5 ml tube geben - Gut mischen und alles in eine Küvette pipettieren - Photometrische Konzentrationsbestimmung mit ddh 2 O als blank A) Warum müssen die Restriktionsenzyme vor der Ligation aus dem Ansatz entfernt werden? 1 g) Ligation von Vektor und PCR-Produkt In der Ligationsreaktion katalysiert die T4 DNA Ligase die Bildung von Phosphodiesterbindungen zwischen 5'-Phosphatenden und 3'-Hydroxylenden von DNA-Molekülen. Dabei hängt die Dauer und Effizienz der Reaktion nicht nur vom Enzym, sondern auch vom Vektor und den verwendeten Schnittstellen ab. 1) Prepare the following reaction mixture containing: ligation Vector control Linear vector DNA ng ng Insert DNA 3 : 1 molar ratio over vector - 10x T4 DNA Ligase Buffer 2 µl 2 µl T4 DNA Ligase 0.5 µl 0.5 µl ddh 2 O up to 20 µl

10 2) Mix gently, spin briefly and incubate at 22 C for 1 hour. To calculate the appropriate amount of PCR product (insert) to include in the ligation reaction, use the following equation. ng of vector kb size of insert 3 = ng of insert kb size of vector 1 A) Warum verwendet man ein Verhältnis von 1:3 (Vektor:Insert) für die Ligation? 1 h) Transformation von E. coli DH5α mit Ligationsprodukt Mit dem erhaltenen Ligationsprodukt werden nun die zu Beginn des Praktikums hergestellten chemisch kompetenten Zellen transformiert. Dabei erfolgt auch eine Kontrolle der Zellen auf eine eventuelle Kontamination. Dabei wird statt der Ligation 10 µl Wasser zu den kompetenten Zellen gegeben und nach der Transformation alles auf eine Ampicillinhaltige LB Platte ausplattiert. Vor der Transformation werden LB-Agarplatten die das entsprechende Antibiotikum enthalten (in dem Fall Ampicillin) gegossen. Dazu wird das LB-Medium in der Mikrowelle geschmolzen, nach dem Abkühlen auf ca. 50 C, wird dann Ampicillin in einer Endkonzentration von 100 µg/ml dazugegeben. Die Stammlösung Ampicillin hat eine Konzentration von 100 mg/ml. Jede Gruppe braucht vier Platten (zwei für die Ligation, zwei für die beiden Kontrollen (Vektorkontrolle und Zellenkontrolle)). 1) Thaw per ligation (three per group) one tube of competent cells on ice 2) Add 10 µl of the ligation to the competent cells and mix by flicking the tube. 3) Incubate on ice for 30 min 4) Heat-shock the cells for 1 min at 42 C 5) Immediately incubate on ice for 2 min 6) Add 500 µl pre-warmed SOC-medium to the cells 7) Incubate for 45 min at 37 C under shaking 8) Spread 100 µl of the cells onto LB plate containing ampicillin (100 µg/ml) 9) Centrifuge the remaining cells for 30 sec, remove 400 µl of the supernatant and resuspend the cells in the remaining supernatant, then spread onto another LB plate 10) Incubate the plates overnight at 37 C A) Warum können die Zellen nicht direkt nach dem Hitzeschritt ausplattiert werden? B) Wie wirkt Ampicillin? C) Welches Ergebnis erwarten Sie für die Vektorkontroll-Ligation, was sagt das Ergebnis aus?

11 1 i) Kontrolle der Klonierung mittels Kolonie-PCR Zur Überprüfung ob man Klone mit Plasmiden erhalten hat, in die erfolgreich das PCR- Produkt ligiert wurde, wird die Methode der Kolonie-PCR angewendet. Mit Hilfe dieser Methode kann man schnell eine größere Anzahl von Klonen screenen, ohne dass eine DNA- Extraktion durchgeführt werden muss. Abbildung 4 Plasmid ptrchis_a mit Position der Primer für die KoloniePCR (Primer in rot) 1) Vorbereitung von 7 Kulturröhrchen mit je 3 ml LBAmp (Beschriftung!!) 2) Vorbereitung von 7 Eppis mit je 30 µl H 2 O (6 Kolonien, 1 Negativkontrolle) 3) Auswahl von 6 Kolonien auf der Agarplatte (auf Unterseite markieren) 4) E. coli Kolonie mit einem Zahlstocher in das Eppi mit 30 µl H 2 O überführen, kurz drehen und dann weiter in das entsprechende Kulturröhrchen überführen (!!auf die Beschriftung achten!!) 5) Inkubation der Eppis fürs C 6) Ansetzen der PCR, Mastermix in einem 1,5 ml Eppi vorbereiten PCR-Mastermix Konzentration Konzentration 1x 8 x der Stammlösung in der PCR Taq PCR buffer 10x 1x µl µl dntp s 2 mm 100 µm µl µl Primer 5 µm 0,3 µm µl µl ptrchis_a_fw Primer 5 µm 0,3 µm µl µl ptrchis_a_rv Taq home made 1 µl µl ddh 2 O µl µl 40 µl (Final 50 µl, Siehe Schritt 7) 7) MM auf die PCR Eppis aufteilen (Beschriftung) und 10 µl Template DNA hinzufügen

12 PCR-Programm 96 C 3 96 C C 1 35 x 72 C 2 72 C 5 8) Herstellung eines 1%igen Agarosegels 9) Je 10 µl der PCR mit 3 µl DNA-Ladepuffer versetzen und auf das Gel auftragen 10) Analyse des Gels und Bestimmung der positiven Kolonien 11) Auswahl der Kulturröhrchen für die DNA-Miniprep (max Anzahl: 2) D) Warum werden die Zellen vor der PCR erhitzt? E) Welche Fragmentgröße in der PCR erwarten Sie, falls die Klonierung erfolgreich war (Fragmentgröße leerer Vektor: 232 bp)? F) Welche anderen Methoden kommen in Frage um eine erfolgreiche Klonierung zu überprüfen? 1 j) DNA-Plasmidpräparation (Miniprep) Die Isolierung von Plasmid-DNA aus Bakterienzellen ist für die Analyse rekombinanter Klone essentiell. Es existieren viele verschiedene Miniprep-Verfahren zur Isolierung von Plasmid DNA. Dabei ist die Plasmidisolierung mittels DNA-bindender Silicasäulchen zur Routineanwendung geworden. Pro Gruppe werden 2 Minipreps durchgeführt. 1) Place Binding Buffer on ice 2) Add 250 µl Suspension Buffer to the centrifuge tube containing the bacterial pellet 3) Resuspend the bacterial pellet and mix well 4) Add 250 µl Lysis Buffer 5) Mix gently by inverting the tube 5 times!!! To avoid shearing genomic DNA, do not vortex!! 6) Incubate for 5 min at Room temperature! 7) Add 350 µl chilled Binding Buffer 8) Mix gently by inverting the tube 5 times 9) Incubate on ice for 5 min (The solution should become cloudy and a precipitate should form) 10) Centrifuge for 10 min at approx. 13,000 x g (full speed) in a standard tabletop microcentrifuge 11) Insert one High Pure Filter Tube into one Collection Tube 12) Transfer entire supernatant from Step 10 into upper buffer reservoir of the Filter Tube 13) Insert the entire High Pure Tube assembly into the microcentrifuge 14) Centrifuge for 60 s at full speed

13 15) Remove the Filter Tube from the Collection Tube, discard the flowthrough liquid, and reinsert the Filter Tube in the same Collection Tube 16) Add 700 µl Wash Buffer II to the upper reservoir of the Filter Tube 17) Centrifuge for 60 s at full speed and discard the flowthrough 18) Centrifuge the entire High Pure Tube assembly for an additional 30 to 60 s to remove residual Wash Buffer 19) Discard the Collection Tube 20) Insert the Filter Tube into a clean, sterile 1.5 ml microcentrifuge tube 21) Add 100 µl Elution Buffer to the upper reservoir of the Filter Tube 22) Centrifuge the tube assembly for 60 s at full speed 23) Bestimmung der DNA-Konzentration am Photometer (siehe 1c) A) Wie erfolgt die Lyse der Bakterienzellen? B) Worauf beruht das Prinzip der DNA-Binding an die Silicamembran? C) Warum wird nur Plasmid-DNA, nicht aber genomische DNA mit dieser Methode gereinigt? 1 k) Kontrolle der Klonierung mittels Restriktionsanalyse Eine weitere Methode zur Überprüfung einer erfolgreichen Klonierung ist die Restriktionsanalyse. Meistens wird dabei das erhaltene Plasmid mit denselben Restriktionsenzyme, die für die Klonierung verwendet wurden, geschnitten. Zur weiteren Kontrolle kann man auch Restriktionsenzyme verwenden, die im gewünschten Gen schneiden. Der Restriktionsverdau wird dann mittels einer Gelelektrophorese kontrolliert und analysiert. 1) Agarosegel 1% gießen 2) Restriktionsanalyse in 1,5 ml Eppis ansetzen (Beschriftung!!) Miniprep 1 Miniprep EcoRI BglII + BamHI Kontrolle EcoRI BglII + BamHI Kontrolle EcoRI EcoRI Buffer O 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl 10x DNA 300 ng µl µl µl µl µl µl µl µl EcoRI 1 µl 1 µl µl 1 µl U/µl BglII - 1 µl µl U/µl BamHI µl µl - 1 U/µl ddh 2 O µl µl µl µl µl µl µl µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 10 µl 3) Vortexen und leicht anzentrifugieren

14 4) Inkubation 20 min 37 C 5) Zugabe von 3 µl DNA-Ladepuffer pro Eppi 6) Gelelektrophorese A) Was versteht man bei Restriktionsenzymen unter der Angabe X Unit/µl? B) Geben Sie die DNA-Sequenz von GFP (Siehe Anhang) in den NEBCutter ein ( und ermitteln Sie damit die Schnittstelle von BamHI im Gen. Achtung BamHI schneidet auch in der MCS des Plasmids. Vergleichen Sie die errechneten Fragmentgrößen mit den tatsächlichen auf dem Gel! 2) Funktionelle Analyse des GFP mittels Mutagenese-PCR 2 a) Mutagenese-PCR Eine Möglichkeit, Punktmutationen, Deletionen und Insertionen in spezifische Gene einzuführen, ist das sogenannte QuickChange-Verfahren. Bei dieser Methode wird die gewünschte Veränderung mittels PCR direkt in das in einem Vektor befindliche Gen eingefügt. Für die Mutagenese-PCR werden Mutageneseprimer generiert, die im 5 - und 3 - Bereich eine etwa 20 nt lange Sequenz besitzen, die komplementär zu dem Bereich des Genes ist, in den die Mutation eingeführt werden soll. In der Mitte des Primers befindet sich die auszutauschende Sequenz. (Siehe Anhang) Bei der Mutageneseprozedur wird doppelsträngige Plasmid-DNA verwendet, die das zu mutierende Gen trägt. Nach der Denaturierung des Vektors lagern sich die beiden Mutageneseprimer an und werden anschließend in einer Amplifikationsreaktion verlängert, bis ein kompletter DNA-Ring entstanden ist. Diese DNA-Ringe sind allerdings noch nicht verschlossen, sondern liegen mit sogenannten Einzelstrangbrüchen ( nicked circles ) vor. Mit diesem DNA-Gemisch werden kompetente E. coli-zellen transformiert. Sobald die DNA von den E. coli-zellen aufgenommen wurde, werden die noch vorhandenen Einzelstrangbrüche durch E. coli-eigene Enzyme geschlossen und die Plasmide sind in der Lage zu replizieren und das mutierte Protein zu exprimieren. Abbildung 5 Schematische Darstellung der QuickChange-Mutagenese mit anschließendem Abbau der Wildtyp-DNA durch DpnI (nach Makarova et al., 2000). Der ausgetauschte / mutierte Sequenzabschnitt ist durch ein gelbes Kreuz gekennzeichnet.

15 Ziel des Versuches ist es, mittels Mutation das GFP funktionsunfähig zu machen. Dabei soll das für die Fluoreszenz essentielle Serin (S64) durch ein Alanin ersetzt werden (S64A). (DNA- Sequenzen, siehe Anhang) 1) Ansetzen des PCR-Mastermix (1, 5 ml Eppi) Konzentration Konzentration 1x 2,5 x der Stammlösung in der PCR Pfu PCR buffer 10x 1x µl µl dntp s 2 mm 200 µm µl µl Primer 5 µm 0,3 µm µl µl GFP_Mut_fwd Primer 5 µm 0,3 µm µl µl GFP_Mut_rv Pfu Fermentas 2,5 U/ µl 1,25 U 0,5 µl µl ddh 2 O µl µl 49 µl (final 50 µl mit template) 2) Pipettieren Sie dafür alle Komponenten außer dem DNA-Template zusammen und vortexen Sie den Ansatz kurz. Zu dem Positivansatz (+) geben Sie das DNA-Template (100 ng DNA, 1 µl), zu dem Ansatz der Negativkontrolle 1 µl Menge Wasser. Beide Ansätze werden erneut kurz gevortext, anzentrifugiert und in den Thermocycler überführt. PCR-Programm 96 C 3 96 C C 2 25 x 68 C 15 3) 1 % Agarosegel gießen 4) 100 ng Plasmid-DNA (template DNA für PCR) auf 10 µl mit DDH2O auffüllen 5) Je 10 µl PCR Produkt und Plasmid-DNA mit je 3 µl DNA Loading dye mischen 6) Agarose-Geleelektrophorese A) Warum handelt es sich bei dieser Methode nicht um eine PCR im klassischen Sinne? B) Warum wird für diese PCR die Pfu Polymerase verwendet? C) Warum dauert der Elongationsschritt der PCR so lang? 2 b) DpnI Restriktionsverdau Der Mutagenese-PCR-Ansatz enthält sowohl das Ausgangsplasmid als auch die neuen, die Mutation tragenden DNA-Stränge. Während das Wildtyp-Plasmid aus einem Dammethylierenden E. coli Stamm isoliert wurde und somit das typische Methylierungsmuster

16 trägt, sind die mittels PCR erzeugten DNA Stränge unmethyliert. Eine Behandlung mit der Restriktionsendonuklease Dpn I, die spezifisch für methylierte DNA ist, ermöglicht den selektiven Abbau der Wildtyp-DNA. 1) Zugabe von 1 µl DpnI in den positiven Reaktionsansatz (nicht in die Negativkontrolle) 2) Inkubation für 2 h bei 37 C A) Ermitteln sie die Zielsequenz von DpnI! Wie of wird das Plasmid mit diesem Enzym theoretisch geschnitten? B) Gibt es noch andere Restriktionsenzyme, die speziell methylierte DNA schneiden? 2 c) Transformation von E. coli mit dem Mutagenese PCR-Produkt Vor der Durchführung der Transformation werden noch die benötigten LB-Agar Platten hergestellt. Dazu wird der LB-Agar verflüssigt (Mikrowelle). Nachdem das Medium abgekühlt ist werden folgende Reagenzien zugegeben: LB-Agar Konzentration in der LB- Agar Platte Herstellung 150 ml (5-6 Platten) Ampicillin 100 mg/ml 100 µg/ml µl IPTG 200 mm 100 µm µl Für eine LB-Agar Platte benötigt man ca. 25 ml Medium. Agarplatten werden stets am Rand der Unterseite beschriftet. Die Beschriftung sollte folgende Angaben enthalten: - Datum - Name (Gruppennummer) - Kürzel (PCR bzw. Ø- oder puc-kontrolle, Mengenangabe) Zur Selektion einzelner Klone werden chemisch kompetente E. coli DH5α mit dem DpnIbehandelten Mutageneseansatzes (4 µl) transformiert. Zur Überprüfung der Transformationseffizienz wird eine Transformation mit dem Plasmid puc mitgeführt. Zellen Zugabe von Platte Menge Ausplattiert 1.Eppi Mutageneseansatz µl (Schritt 8) 4 µl PCR 2 Rest (Schritt 9) 2.Eppi Ausgangsplasmid für die µl (Schritt 8) Mutagenese 10ng 3.Eppi puc (2 ng/µl) 4 µl µl (Schritt 8) 4.Eppi ddh 2 O 4 µl 5 Gesamter Ansatz (Schritt 9) 1) Thaw per reaction one tube of competent cells on ice (Beschriftung!!)

17 2) Add 4 µl of the reaction (see table) to the competent cells and mix by flicking the tube. 3) Incubate on ice for 30 min 4) Heat-shock the cells for 1 min at 42 C 5) Immediately incubate on ice for 2 min 6) Add 500 µl pre-warmed SOC-medium to the cells 7) Incubate for 30 min at 37 C under shaking 8) Spread 100 µl of the cells onto LB plate 9) Centrifuge the remaining cells for 30 sec, remove 400 µl of the supernatant and resuspend the cells in the remaining supernatant, then spread onto another LB plate 10) Incubate the plates overnight at 37 C Bestimmen sie die Transformationseffizienz der Zellen. Dazu werden Kolonien der beiden Platten mit der puc-kontrolle gezählt und aus der eingesetzten DNA-Menge die Transformationsrate (Kompetenz der Zellen) bestimmt. Kolonienzahl Transformationsrate = (µg) Plasmid * (ml) kompetente Zellen A) Welche andere Methode gibt es noch E. coli zu transformieren? B) Warum wird dem Agar IPTG zugesetzt? C) Wie ist die Funktionsweise von IPTG in der Zelle? 2 d) Analyse der hergestellten Protein-Varianten Nach der Transformation von E. coli mit den entsprechenden mutanten DNA-Strängen, können die mittels Mutagenese-PCR neu hergestellten Proteinvarianten in E. coli exprimiert werden. Im vorliegenden Versuch steht das im ptrchisa-vektor befindliche GFP-Gen unter der Kontrolle eines ptac Promotors. Die Bezeichnung tac setzt sich zusammen aus trp und lac, den Namen der Operons die zur Herstellung des tac-konstrukts verwendet wurden. Dieser Promotor ist ein starker Promotor, der durch Galactose (bzw. IPTG) induziert werden kann. Die LB-Agar Platten mit den Kolonien von der Transformation werden nach Auszählung der Kolonien auf einem UV-Tisch analysiert. A) Wie funktioniert das Lac-Operon B) Warum erfolgt eine Induktion mit IPTG statt mit Galactose?

18 3) Heterologe Genexpression und Proteinreinigung mittels Histag Die Klonierung des GFP erfolgte C-Terminal von einem Histag. Die Expression des GFP erfolgt daher als Fusionsprotein mit einer Hexahistidinsequenz. Dieses Protein lässt sich nun mit einer Nickelaffinitätschromatographie reinigen. 3 a) Proteinexpression mittels IPTG Der Ablauf einer typischen Expression ist es, die Zellen erst zu einer bestimmten Zelldichte heranwachsen zu lassen, und dann den Induktor (IPTG) zuzugeben. Da induzierte Zellen langsamer wachsen sie verwenden einen großen Teil ihrer zellulären Ressourcen dazu, das Zielprotein herzustellen ist es so möglich, hohe Zelldichten und damit eine hohen Ausbeute des Zielproteins zu erhalten. Zur Kontrolle des Wachstums der Zellen wird die optische Dichte der Bakteriensuspension bei 600 nm verfolgt (OD 600) Aus Zeitgründen wurde bereits am Morgen zwei 100 ml Kulturen mit dem Plasmid ptrchisa_gfp transformierte E. coli angeimpft. 1) Messen sie die OD 600 beider Kulturen, protokollieren sie das Wachstum. 2) Bei einer OD 600 von 0,6 bis 0,8: Nehmen sie von beiden Kulturen eine 1 ml Probe. Induzieren sie die Expression des GFP in einer der beiden Kulturen mit 1 mm IPTG. Die zweite Kultur ist dient zur Kontrolle des Wachstums und der Expression. 3) Alle Proben werden im Weiteren wie folgt behandelt: 1 min bei rpm zentrifugieren; Überstand abkippen (restliche Lösung auf Papiertuch abklopfen) und Zellpellet bis zur weiteren Verwendung einfrieren 4) Nach der Induktion der Expression aller 30 min eine Probe abnehmen, die OD 600 bestimmen (Stellen Sie den Verlauf des Wachstums (OD 600 versus Zeit) grafisch dar) und die Proben zentrifugieren (Schritt 3) 5) Visuelle Kontrolle der Expression unter der UV-Lampe 6) Nach der letzten OD-Messung um Uhr wird die Expressionskultur in ein 50 ml- Falcon überführt und die Zellen 10 min bei 5000 rpm (4 C) zentrifugiert und geerntet. Der Rest der Kultur wird so lange auf Eis bzw. im Kühlschrank aufbewahrt. 7) Nach der Zentrifugation wir der Überstand abgekippt und die restliche Kultur im selben Falcon abzentrifugiert. 8) Falcon mit Kulturgesamtmenge, Konstruktname, Gruppennummer etc. beschriften und bei -80 C bis zur weiteren Verwendung einfrieren A) In welcher Wachstumsphase der Zellen erfolgt die Induktion der Expression? 3 b) Zellaufschluss Der erste Schritt in der Reinigung des Proteins stellt der Zellaufschluss und das Abtrennen von unlöslichen Zellbestandteilen dar.

19 Wichtig: Die Zellen, der Rohextrakt und die Proben sollten, soweit möglich und nicht anders angegeben, immer auf Eis gelagert werden, um eventuelle Proteindegradation zu verhindern. 1) Zugabe von 700 µl Lysis-Puffer (50 mm Tris-HCl ph 8, 300 mm NaCl, 10 mm Imidazol) 2) Resuspendierung der Zellen durch vorsichtiges auf- und abpipettieren 3) Nehmen Sie 20 µl dieser Lösung ab (1,5 ml-eppi), das ist die Probe Gesamtprotein für das SDS Gel 4) Zugabe von Lysozym (Stock: 20 mg/ml) bis zu einer Endkonzentration von 2 mg/ml 5) Suspension für 10 min bei -70 C inkubieren 6) Suspension bei RT auftauen und 5 min belassen 7) Die letzten beiden Schritte wiederholen 8) Suspension 15 min bei 4 C und rpm zentrifugieren 9) Pellet und Überstand hinsichtlich der Färbung unter dem UV-Licht vergleichen (war der Aufschluß quantitativ?) 10) Den Überstand in ein neues Eppi überführen und sein Volumen bestimmen 11) Nehmen Sie 20 µl dieser Lösung ab (Probe Protein löslich für das SDS Gel) A) Welche weiteren Methoden für einen Zellaufschluss kennen Sie? B) Wie funktioniert die Zelllyse mit Lysozym? 3 c) Proteinreinigung mit HisTag Die in E. coli überexprimierten Proteine sind mit einem His 6 -Tag versehen. Bei der Nickelaffinitätschromatoghraphie wird die Fähigkeit von Histidinresten an Nickelionen zu binden genutzt. Dabei wird der Proteinrohextrakt, der die getaggten Proteine enthält, zu einer Matrix gegeben, an der Nickelionen immobilisiert sind. Die getaggten Proteine binden an die immobilisierten Nickelionen und können so relativ leicht von den in Lösung verbleibenden restlichen Proteinen getrennt werden. Das Entfernen unspezifisch gebundener Proteine und die Elution der aufgereinigten Proteine von der Matrix erfolgt mit steigenden Konzentrationen an Imidazol. In hohen Konzentrationen verdrängt Imidazol auch mit relativ hoher Affinität gebundene Proteine und so erfolgt die Elution des Zielproteins. 1) Entfernen Sie den Pufferüberstand aus dem Eppi mit der Ni-NTA-Agarose Vorsicht: Keine Agarosematrix mit entfernen!! 2) Pipettieren Sie ihren Proteinrohextrakt vollständig in das Eppi mit der Ni-NTA- Agarose 3) Inkubation für 1 Stunde bei 4 C unter leichtem Schütteln 4) Zentrifugation für 15 s bei 1000 g, um die Agarosemarix zu pelletieren. 5) Nehmen Sie den Überstand ab und überführen Sie diesen in ein neues Eppi (Lagerung auf Eis) Vorsicht: Keine Agarosematrix mit transferieren. (Probe: ungebundenes Protein für das SDS-Gel 6) Zugabe von 400 µl Waschpuffer I (WI) (50 mm Tris HCl ph 8; 300 mm NaCl, 20 mm Imidazol) zur Agarosematrix 7) Resuspendieren durch invertieren des Eppis, Inkubation für 5 Minuten auf Eis 8) Zentrifugation für 15 s bei 1000 g, nehmen Sie den Überstand ab und lagern Sie diesen auf Eis (Probe: Protein WI für das SDS-Gel

20 9) Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 mit 400 µl Waschpuffer II (WII) (50 mm Tris HCl ph 8; 300 mm NaCl, 60 mm Imidazol) (Probe: Protein WII für das SDS- Gel) 10) Wiederholen Sie die Schritte 5 bis 7 2 mal mit 100 µl Elutionspuffer (E) (50 mm Tris HCl ph 8, 300 mm NaCl, 500 mm Imidazol) (Proben: Protein E1 und Protein E2 für das SDS-Gel 11) Respuspendieren Sie die Agarosematix abschließend in 100 µl Elutionspuffer (Probe: Protein Matrix für das SDS-Gel 12) Die gesammelten Proben werden bei -20 C gelagert bis zum nächsten Praktikumstag. A) Welche anderen Proteintags kennen Sie? B) Welche anderen Methoden zur Proteinreinigung kennen Sie? 3 d) SDS-Gelelektrophorese Durch der SDS-Gelelektrophorese kann mittels eines Polyacrylamidgels ein Proteingemisch anhand seiner Größe getrennt werden. Dieses Gel enthält zusätzlich SDS (Natriumdodecylsulfat), dadurch erhalten die Proteine eine konstante negative Ladungsverteilung und die Proteine wandern kontinuierlich im elektrischen Feld. Herstellung des Gels: 1) Mischen Sie 12,5 ml des Trenngels mit 10 μl TEMED und 125 μl 10 % (w/v) APS Vorsicht: Durch APS und TEMED wird die Polymerisation gestartet, schnell zugeben und dann das Gel zügig gießen. 2) Gel bis ca. 1 cm unterhalb der Taschen gießen 3) Mischen Sie zügig 5 ml des Sammelgels mit 10 μl TEMED und 50 μl 10 % (w/v) APS. Überschichten Sie nun vorsichtig das Trenngel mit der Sammelgellösung und setzen Sie den Kamm ein. 4) Polymerisation für 30 min 5) Proben mit der entsprechenden Menge 4fach Ladepuffer resuspendieren um am Ende eine 1fach Lösung zu erhalten

21 # Beschriftung Menge für das SDS Gel 4fach Ladepuffer 1 Gesamtprotein vor Induktion 15 µl µl der Expression 2 Gesamtprotein nach Induktion 15 µl µl der Expression 60min 3 Gesamtprotein nach Induktion 5 µl µl (Zellaufschluss) 4 Lösliches Protein 5 µl µl 5 ungebundenes Protein 5 µl µl 6 Protein WI 15 µl µl 7 Protein E1 10 µl µl 8 Protein E2 10 µl µl 9 Protein Matrix 10 µl µl 10 Protein Marker unstained 5 µl 6) Proben 5 min bei 95 C erhitzen 7) Gelkamm entfernen, Taschen mit Puffer spülen, Proben auftragen 8) Gellauf im Sammelgel: 60 V 9) Gellauf im Trenngel: 200V bis die Bromphenolblau-Front aus den unteren Rand des Gels erreicht 10) Färben des Gels mit Coomassie Brilliant Blue a) Gel mit Wasser kurz abspülen b) Zugabe von Färbelösung (Gel sollte bedeckt sein) c) 1 min Mikrowelle d) 30 min sanft schütteln e) Färbelösung abgießen f) 1 min Mikrowelle g) 30 min sanft schütteln h) Färbelösung abgießen i) Zugabe von Wasser j) Fotografieren des Gels (4.Etage Gelraum) 11) Ermitteln Sie die Größe des GFP anhand des Geles und vergleichen Sie den ermittelten Wert mit der tatsächlichen Größe des Proteins. A) Was ist Coomassie Brilliant Blue und wie funktioniert die Färbung von Proteinen? B) Was ist Temed und APS und wofür wird es benötigt? C) Warum werden die Proben vor dem Auftragen auf das Gel erhitzt? 3 e) Bradford Proteinbestimmung Der Bradford-Test ist eine photometrische Methode zur quantitativen Bestimmung von Proteinen. Bei dieser Methode bindet der Farbstoff Coomassie Brilliant Blue G-250 bindet an aromatische und basische Aminosäurereste. Der entstandene Protein-Farbstoffkomplex kann bei 595 nm detektiert werden und ist ein Maß für die Proteinkonzentration der Lösung. Rinder-Serum-Albumin (BSA) hat sich als international anerkannter Standard für die Eichung durchgesetzt.

22 1. Ansetzen einer BSA Eichreihe: # Konzentration final µl BSA (0,2 µg/µl) µl DDH2O ( 20 µl) µg / ml 20 µg / ml 60 µg / ml 100 µg / ml 140 µg / ml 160 µg / ml 200 µg / ml ) Vorbereitung der Proben: # E1 µl DDH2O ( 20 µl) 8 2 µl 9 4 µl µl # E2 µl DDH2O ( 20 µl) 11 2 µl 12 4 µl µl 2. Bradford Reagenz verdünnen 1:5 3. Zugabe von 1 ml Bradfordlösung zur Probe 4. Inkubation für 5 min 5. Messung der Standardkurve und der Proben bei OD Fertigen Sie eine Eichgerade an und ermitteln die die Proteinkonzentration ihrer Proben (Mittelwert angeben). A) Welche anderen Möglichkeiten zur Bestimmung der Proteinkonzentration in einer Lösung kennen Sie. Was sind die Vor- und Nachteile der verschiedenen Methoden?

23 Anhang Gensequenz des GFP Die Aminosäuren für den Aufbau des Chromophors sind in rot dargestellt. ATGGCTAGCAAAGGAGAAGAACTTTTCACTGGAGTTGTCCCAATTCTTGTTGAATTAGATGG TGATGTTAATGGGCACAAATTTTCTGTCAGTGGAGAGGGTGAAGGTGATGCTACATACGGAA AGCTTACCCTTAAATTTATTTGCACTACTGGAAAACTACCTGTTCCGTGGCCAACACTTGTC ACTACTTTCTCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATCCGGATCATATGAAACGGCATGA CTTTTTCAAGAGTGCCATGCCCGAAGGTTATGTACAGGAACGCACTATATCTTTCAAAGATG ACGGGAACTACAAGACGCGTGCTGAAGTCAAGTTTGAAGGTGATACCCTTGTTAATCGTATC GAGTTAAAAGGTATTGATTTTAAAGAAGATGGAAACATTCTCGGACACAAACTCGAGTACAA CTATAACTCACACAATGTATACATCACGGCAGACAAACAAAAGAATGGAATCAAAGCTAACT TCAAAATTCGCCACAACATTGAAGATGGATCCGTTCAACTAGCAGACCATTATCAACAAAAT ACTCCAATTGGCGATGGCCCTGTCCTTTTACCAGACAACCATTACCTGTCGACACAATCTGC CCTTTCGAAAGATCCCAACGAAAAGCGTGACCACATGGTCCTTCTTGAGTTTGTAACTGCTG CTGGGATTACACATGGCATGGATGAGCTCTACAAATAA Translate : M A S K G E E L F T G V V P I L V E L D G D V N G H K F S V S G E G E G D A T Y G K L T L K F I C T T G K L P V P W P T L V T T F S Y G V Q C F S R Y P D H M K R H D F F K S A M P E G Y V Q E R T I S F K D D G N Y K T R A E V K F E G D T L V N R I E L K G I D F K E D G N I L G H K L E Y N Y N S H N V Y I T A D K Q K N G I K A N F K I R H N I E D G S V Q L A D H Y Q Q N T P I G D G P V L L P D N H Y L S T Q S A L S K D P N E K R D H M V L L E F V T A A G I T H G M D E L Y K Primer PCR Klonierung GFP_fwd_BglII 5 - CTCGAGATCTATGGCTAGCAAAGGAGAAGAAC-3 TMhead: 55 C, Länge: 32 nt, GC-Gehalt: 47% GFP_rv_ EcoRI 5 - CTTCGAATTCTTATTTGTAGAGCTCATCCATGC- 3 TMhead: 53 C, Länge: 33 nt, GC-Gehalt: 40% Primer Kolonie-PCR #ptrchisafwd_2: 5 - GAGGTATATATTAATGTATCG -3 Tm 45 C, 21 bp, GC 28% #ptrchisarv: 5 - TCAGGCTGAAAATCTTCTCTCATC -3 Tm 54 C, 24 bp, GC 42%

24 Primer Mutagenese-PCR GFP_Mut_fwd 5 - CTACTTTCGCTTATGGTGTTCAATGCTTTTCCCGTTATC - 3 Tmhead: 57 C, Länge: 39 nt, GC-Gehalt: 41% GFP_Mut_ rv 5 - CACCATAAGCGAAAGTAGTGACAAGTGTTGGCCAC- 3 Tmhead: 57 C, Länge: 35 nt, GC-Gehalt: 49%

25 GeneRuler DNA Ladder Mix Fermentas

26 Proteinmarker SDS Trenngel (ph 8.8) 200ml 10 % 30% acrylamide stock 66,8 ml 1M Tris ph ml 20%SDS 0,5 ml 80 % glycerin 13,4 ml water 41,3 ml SDS- Sammelgel (ph 6.8) 25ml 4 % 30% acrylamide stock 33,5 ml 0,5M Tris ph ,5 ml 20% SDS 1,25 ml water 152,75 ml 4x loading buffer 25ml 6% SDS 7,5 ml 20% SDS 30% glycerol 7,5 ml 100% glycerol 15% -Mercaptoethanol 3,75 ml 0,1875M Tris ph 6.8 4,688 ml 1M Tris ph 6.8 Bromphenolblue 3-4 mg water ad volume to 25ml