Anwendungsbericht zur Herstellung des Proteins GST-GFP-NLS

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1 Anwendungsbericht zur Herstellung des Proteins GST-GFP-NLS Von: Andreas Tschammer, Fachhochschule Aalen-Hochschule f. Technik und Wirtschaft, Fachbereich Chemie, Schwerpunkt Molekulare Biotechnologie Material Bezeichnung Hersteller Kat-Nr.: Ampicillin Merck APS (Ammoniumperoxodisulfat) Carl Roth GmbH Bradford-Dye Bio-Rad - BSA (Rinderserumalbumin) Bio-Rad - Coomassie R250 Pierce DTT (Dithiothreitol) Gerbu 1008 EDTA (Ethylendiaminotetraessigsäure) Applichem A EGTA (Ethylenglykol-bis(aminoethylether)-N,N'- Tetraessigsäure) Applichem A Glutathion-IDA-Agarose Biontex R Glutathion (reduziert) Carl Roth GmbH Glycin Carl Roth GmbH Hefeextrakt Difco IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid) Carl Roth GmbH ß-Mercaptoethanol Sigma M3148 Pepton Gibco x Probenpuffer (SDS-Page Gel) Carl Roth GmbH K929.1 Proteasehemmer Roche Complete mini Protein-Standard Bio-Rad Rotiphorese Gel 30 (37,5:1) Carl Roth GmbH SDS (Natriumdodecylsulfat) Carl Roth GmbH TEMED (N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin) Carl Roth GmbH Triton X-100 Applichem A TRIS (Tris(hydroxymethyl)-aminomethan) Carl Roth GmbH AE15.2 Transformation Zur Herstellung des Proteins GST-GFP-NLS (ca. 60kDa) wurden die kompetenten Bakterienzellen BL21(DE3)pLysS mit dem Plasmid pgex-5x-nls-gfp transformiert. Diese Transformation erfolgte nach Stratagene-Protokoll in Falcon Tubes mit 100 µl kompetenten Zellen und 1 µl (2 ng/µl) DNA. Hiervon wurden je 100 µl auf LB-Platten (Agar/Ampicillin) über Nacht bei 37 C inkubiert.

2 Vorkultur 20 ml LB-Medium wurden mit 20 µl Ampicillin-Stocklösung mit einer Einzelkolonie angeimpft und über Nacht (20 min) bei 37 C / 225 U/min inkubiert. Hauptkultur Mit 5 ml der Vorkultur wurden 200 ml LB-Medium mit 200 µl Ampicillin-Stocklösung angeimpft und bei 37 C / 225 U/min geschüttelt. Hiervon wurde alle halbe Stunde die OD bei 600 nm gegen LB-Medium als Leerwert gemessen. Ergebnis: Expression Die Proteinexpression in der Hauptkultur (200 ml) wurde 200 µl 1 M IPTG (1 mm in der Kultur) induziert und bei 18 C über Nacht (21 h) mit 250 U/min inkubiert. Die resultierende OD 600 lag bei 1,583. Abtrennung des Proteins Die Bakterienkultur (200 ml) wurde bei 8000 x g und 4 C in 50 ml Tubes (4 Tubes) 10 min zentrifugiert. Die Überstände wurden verworfen. Das Pellet wurde in je 2 ml eisgekühltem Lysispuffer durch vortexen resuspendiert. Hierzu wurden 0,5 µl β-mercaptoethanol gegeben. In die Suspension wurde eine Ultraschallsonde getaucht und unter Eiskühlung 4 x 10 s bei 40 W beschallt. Zur Abtrennung der Zelltrümmer erfolgte ein weiteres Zentrifugieren bei 12000g und 4 C, 10 min. Der Überstand wurde je 2 ml in 2 Zentrifugenröhrchen pipettiert und bis zur weiteren Aufarbeitung bei 80 C eingefroren.

3 Proteinbestimmung nach Bradford Standardkurve (1 ml Dye + 20 µl Standard; Leerwert: 1 ml) Bestimmung des Proteingehalts (GST-GFP-NLS) 1 ml Dye + 5 µl Probe d.h. Proteinmenge x 4

4 Reinigung über GST-IDA-Agarose im Batch-Verfahren Die Aufreinigung des Proteins erfolgt analog der Anleitung (Biontex), hier mit 3 ml Agarose, die entsprechend dem Protokoll in 50 ml Zentrifugenröhrchen vorbereitet wurde. Die Inkubation zur Bindung des Proteins an die Agarose erfolgt in 60 min bei 4 C. Die Suspension wurde zentrifugiert und vom Überstand die Proteinmenge bestimmt. Anschließend wurde 3-mal mit PBS, mit folgendem Ergebnis gewaschen: Durch dreimalige Elution mit je 2 ml des Elutionspuffer wurde das Protein gewonnen. Anhand der Standardkurve ergeben sich folgende Proteinkonzentrationen: SDS-Page Gel Es wurde ein 10-Well-Kamm verwendet. Dies führt zu 1 mm großen Taschen für maximal 44 µl Probenvolumen pro Tasche. Als Probenvolumen wurden 20 µl eingesetzt. Dies entspricht etwa 10 µg Protein pro Tasche. Das Gel wurde folgendermaßen beladen: Die Proben wurden bei 95 C 2 min denaturiert und anschließend in die Taschen pipettiert. Am Sammelgel wurden 100 V, am Trenngel 150 V etwa 1 h angelegt.

5 Coomassie-Färbung Zur Färbung wurde das Gel mit Wasser gewaschen, für 2 h in Färbelösung geschüttelt und anschließend erneut mit Wasser gewaschen. Das Gel wurde anschließend ca. 2 h in Entfärbelösung entfärbt, dabei wurde die Lösung mehrmals gewechselt. Abbildung 0.1 SDS-Page-Gel Proteinaufreinigung Die drei Elutionsfraktionen wurden zu je 100 µl in je 20 Eppendorf-Cups abgefüllt und bei 20 C eingelagert.