Versuch Blut Hämoglobin

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1 Versuch Blut Hämoglobin Dieser Versuchstag soll ihnen eine Reihe unterschiedlicher Techniken sowie Eigenschaften von Blutfarbstoffen nahebringen. Blutfarbstoffe dienen im nahezu gesamten Tierreich dem Sauerstofftransport und sind für diese Organismen im Allgemeinen essentiell. Im Tierreich kommt eine kleine Zahl von Blutfarbstoffen zum Einsatz, zu denen Hämoglobin, Hämerythrin und Hämocyanin gehören. Während die ersten zwei dieser Proteine Eisen komplexiert haben, um den Sauerstoff zu binden, übernimmt Kupfer beim Hämocyanin diese Aufgabe. Aus diesem Grund ist das Blut der Tiere, die z.b. Hämoglobin nutzen rot, während das Blut der Hämocyanin nutzenden Organismen (z.b. Molluscen oder Xiphosuren) blau ist. Ein effektiver Gastransport erfordert möglichst große Mengen der sauerstoffbindenden Blutfarbstoffe im Blut oder in der Hämolymphe. Diese Notwendigkeit konkurriert allerdings mit dem osmotischen Wert des Bluts/Hämolymphe, der einen bestimmten Wert nicht übersteigen darf. Daher wird bei Wirbeltieren das Hämoglobin in Erythrozyten verpackt, was die osmotische Wirksamkeit maskiert; bei Molluscen kommt es zu Oligomerisierung des Hämocyanins, was ebenfalls den osmotischen Wert stark reduziert. Hämoglobin: Hämoglobin ist ein tetrameres Protein, das aus 2 alpha und 2 beta-ketten besteht (bei Erwachsenen) und das dem Gastransport im Blut dient.

2 Abb.: Strukturmodell des tetrameren Hämoglobinmolekül. Von zentraler Bedeutung für die Bindung des Sauerstoffs ist der Häm-Anteil des Proteins, in dem die Bindung des Sauerstoffs erfolgt. Außerdem gibt dieser Teil des Moleküls dem Hämoglobin (und dem Blut) die charakteristische Rotfärbung. Der Übergang von deoxygenierten zum oxygenierten Hämoglobin (Bindung des Sauerstoffs) lässt sich photometrisch sehr gut darstellen. Es kommt zu einer messbaren Veränderung der spektralen Eigenschaften des Hämoglobins. Versuchsdurchführung Natrium- Dodecylsulfat- Polyacrylamid- Gelelektrophorese (SDS- PAGE) Die SDS-PAGE ist ein hochauflösendes Trennverfahren für Proteine. Es handelt sich um ein Routineverfahren zur Bestimmung der Molekulargewichte von Proteinen, der Homogenität einer Proteinpräparation sowie der Untereinheitenzusammensetzung eines Proteins. Die Auftrennung erfolgt in einer Gelmatrix, die aus vernetzten, polymerisierten Acrylamidmolekülen besteht. Durch den Zusatz von SDS werden die Proteine denaturiert. Dieses stark anionische Detergenz bindet stöchiometrisch an die Polypeptidketten des Proteins und verleiht ihnen so eine zum Molekulargewicht

3 proportionale, negative Ladung. Nach einer zusätzlichen, reduzierenden Behandlung (mit DTT oder Mercaptoethanol) kann nach Anlegen einer Spannung an das Gel die Auftrennung der Proteine nach ihrer Größe erfolgen, denn die Wanderungsgeschwindigkeit im elektrischen Feld ist proportional zur Molekülgröße. Abb. 2: SDS- PAGE Versuchsaufbau aus: Müller-Erstel, Biochemie 2004 Elsevier GmbH Elektrophoretische Trennung von Hämoglobin Jede Gruppe soll die Ihnen zur Verfügung gestellten Hämoglobinproben (reines Hämoglobin) und das Erythrozytenlysat (Vorsicht: 1: 100 in Wasser vorverdünnen) mit SDS-Probenpuffer versetzen. In der Zwischenzeit können Sie die schon gegossenen Gele entsprechend vorbereiten. D. h., die Kämme müssen vorsichtig entfernt werden (das sollte am Waschbecken erfolgen um sicherzustellen, dass Gelreste abgespült werden. Gele immer mit blauen Nitrilhandschuhen handhaben. Danach werden die Gele in die Apparatur eingespannt und mit SDS-Laufpuffer befüllt. Anschließend werden die unterschiedlichen Proben der Reihe nach aufgetragen. Es wird mit der Pipette jeweils das gesamte Volumen der Probe in jeweils eine Tasche überführt. Anschließend werden die Kammern geschlossen und an den Spannungsgeber angeschlossen.

4 Teilversuch 1: SDS-Page Proben vorbereiten und auf 15%-SDS-Page-Gel analysieren 1. Proben mit 4x SDS-Probenpuffer versetzen jeweils Hämoglobin-Lösung und Erythrozytenlysat (1:100 vorverdünnen!) wie folgt mit 4x SDS-Probenpuffer versetzen: 1. 3 µl Hämoglobin + 1 µl 4x SDS-Probenpuffer µl Hämoglobin + 4 µl 4x SDS-Probenpuffer µl Hämoglobin +10 µl 4x SDS-Probenpuffer 4. 3 µl Erythrozytenlysat (1:100) + 1 µl 4x SDS-Probenpuffer µl Erythrozytenlysat (1:100) + 4 µl 4x SDS-Probenpuffer µl Erythrozytenlysat (1:100) + 10 µl 4x SDS-Probenpuffer 2. Proben ausnahmsweise mal NICHT aufkochen 3. Gelapparatur zusammenbauen und mit 1x SDS-Laufpuffer füllen 4. Proben auf das Gel auftragen siehe Schema nächste Seite 5. An die Spannungsquelle anschließen Proben bei 50 ma einlaufen lassen, danach für etwa 1 Stunde bei 100 ma 6. Gel färben Gel ausbauen und in Färbeschale mit Coomassie-Färbelösung für max. 5 min schwenken 7. Gel entfärben Färbelösung zurück in die Flasche pipettieren, Gel mit Wasser waschen und in der Mikrowelle aufkochen, mehrmals Wasser wechseln und erneut aufkochen bis einzelne Banden sichtbar werden

5 Gel-Auftrags-Schema: Vom Marker (PiNK Prestained Protein Ladder) 10 µl auftragen Von den Proben das gesamte Volumen (4, 14 bzw. 40 µl) auftragen Hämoglobin Erythrozyten-Lysat Marker

6 Durchführung Teilversuch II Bradford Proteinbestimmung Proteinbestimmung nach Bradford Im Vergleich zum vorherigen Teilversuch sollen Sie nicht speziell die Hämoglobinkonzentration bestimmen, sondern die Gesamt-Proteinkonzentration. Die Proteinbestimmung wird nach Bradford, 1976 durchgeführt. Lösungen: Bradford-Reagenz 100 mg Serva Blue G ml 95 % EtOH 100 ml 85 % Phosphorsäure ad 1000 ml mit Aq. bidest BSA (Rinderserumalbumin) NaOH-Lösung 0,4 mg/ml BSA in A. bidest 1 N in A. bidest Bestimmung der Gesamt-Proteinkonzentration 1. Erstellung einer Kalibrierkurve 0, 10, 20, 30, 40 und 50 µl Proteinstandard (400 µg/ml BSA) vorlegen mit 1 N NaOH auf ein Gesamtvolumen von 100 µl auffüllen 2. Probenvorbereitung Hämoglobin-Lösung 1:10 mit 1 N NaOH verdünnen (insges. 100 µl) Erythrozytenlysat 1:100 (in 2 Schritten) mit 1 N NaOH verdünnen (100 µl) 3. Messung am Photometer zum Abgleich des Photometers werden 100 µl 1 M NaOH eingesetzt zu Leerwert und allen Standard- und Proben-Verdünnungen 900 µl Bradfordlösung geben nach ca. 2 min Extinktion aller Proben bei 595 nm bestimmen 4. Bestimmung der Proteinkonzentration Messwerten der Standardverdünnungen in Anhängigkeit von der Proteinkonzentration graphisch auftragen Konzentration der Proben an der Graphik ablesen oder anhand der Geradengleichung errechnen Verdünnungen aus Schritt 2 beachten! Bestimmung der Proteinkonzentration: Bestimmen Sie mit Hilfe der Kalibriergeraden die Proteinmengen der einzelnen Proben. Berechnen Sie die Proteinkonzentration in µg/ml. Die Verdünnung der Proben wird so gewählt, dass die Extinktionen im Bereich

7 der BSA-Kalibrierreihe liegen. Literatur: Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.anal. Biochem., 72, Durchführung Teilversuch III Spektralphotometrie des Hämoglobins Die Spektren sollen einerseits im deoxygenierten Zustand (mit N2-Atmosphäre behandelt) und im oxygenierten Zustand bestimmt werden. Außerdem soll eine komplette Oxygenierung durch den Einsatz von Natriumdithionit erreicht werden. Spektrum von 350 bis 650 aufnehmen 1. Nullabgleich mit H 2 O in der Küvette Spektrum aufnehmen unter Spektrum Spektrum als Nullabgleich auswählen 2. Vor 2. Messung Button Übereinanderlegen auswählen 3. Erythrozytenlysat 1 ml Erythrozytenlysat in eine Küvette füllen und Spektrum aufnehmen 4. Deoxygenierter Zustand Erythrozytenlysat in der Küvette mit Hilfe einer Pipettenspitze mit N2 aus der Gasflasche behandeln und Spektrum aufnehmen 5. Oxygenierter Zustand Deoxygeniertes Erythrozytenlysat in der Küvette wieder mit Luft oxigenieren, dazu mit einer Pipette mehrfach Luft in die Probe sprudeln und erneut Spektrum aufnehmen 6. Komplette Oxygenierung durch Einsatz von Natriumdithionit Lösung aus der Küvette entnehmen und mit 0,5 ml 1% Natriumdithionit-Lösung versetzen PD10-Säule mit 10 ml H 2 O waschen 1,5 ml oxygeniertes Erythrozytenlysat auf die Säule geben mit 0,5 ml H 2 O nachwaschen mit 3 ml H 2 O eluieren, rote Fraktion auffangen und von dieser Spektrum aufnehmen Prinzip: Gelfiltration trennt Substanzen nach Molekulargewicht. Wegen eines Ausschlußeffekts eluieren große Moleküle vor kleineren. In unserem Experiment wird das Erythrozytenysat mit Dithionit reduziert, und das aus dem Methämoglobin entstandene Desoxyhämoglobin wird bei der Passage über die Säule durch die Größenfraktionierung vom überschüssigen Dithionit getrennt. Das Desoxyhämoglobin wird durch Luftsauerstoff oxygeniert und als Oxyhämoglobin eluiert. Durchführung: Eine vorbereitete PD10-Säule wird zuerst mit 10 ml H 2 O gewaschen. Wenn der Pufferspiegel gerade bis auf die Höhe des Säulenmaterials abgesunken ist, wird eine

8 frisch hergestellte Mischung aus 0,5 ml Natriumdithionit-Lösung und 1,0 ml Erythrozytenlysat auf die Säule aufgetragen. Man lässt die Lösung in das Säulenmaterial einsinken. Dann wäscht man zunächst mit 0,5 ml Wasser nach und füllt anschließend die Säule mit 3,0 ml Wasser. Die rotgefärbte Oxyhämoglobin- Fraktion wird aufgefangen und erneut im Photometer gemessen. Durchführung Teilversuch IV Bestimmung des Hämoglobingehalt Bestimmen Sie jeweils den Hämoglobingehalt unter Verwendung des Lambert- Beerschen Gesetzes und dem Extinktionskoeffizienten von Hämoglobin bei 540 nm. Dazu messen Sie die Absorption der Hämoglobinlösung im unverdünnten Zustand bei 540 nm. Molekulare Masse = Da; Extinktionskoeffizient: e = 59 l mmol-1 cm-1. Unter Verwendung des Lambert-Beerschen Gesetzes 1. Nullabgleich unter Werkzeuge Endpunktmessung anwählen Absorption auf 540 nm stellen mit 1 ml Wasser auf 0,000 abgleichen 2. Hämoglobin-Lösung messen Absorption der Probe messen 3. Berechnung des Hämoglobin-Gehalts mit dem Lambert-Beerschen Gesetzes E = ε c d Extinktionskoeffizient: ε = 59 L mmol -1 cm -1 Molekulare Masse = Da