Technologisches Arsenal der Molekularbiologie

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1 Technologisches Arsenal der Molekularbiologie

2 Die zwei Sinne der Molekularbiologie 2. Ein technologisches System 1. Untersuchung der Lebensvorgänge zwischen den Ebenen der DNA und der Zelle Individuumebene Ökosystem Organsystemebene Organebene Gewebeebene Zellebene Atomebene Molekülebene

3 INHALT: 1. Untersuchung oder Umwandlung eines Moleküls oder weniger Molekülen 2. Gleichzeitige Untersuchung von vielen Molekülen (Genomik) 3. Komplexe Techniken (werden in anderen Vorträgen besprochen)

4 INHALT (1. Untersuchung oder Umwandlung eines Moleküls oder weniger Molekülen): 1. Molekulare Klonierung 2. Polymerase Kettenreaktion (PCR) 3. Gelelektrophorese 4. Detektion von Makromolekülen 5. Gelretardation 6. Footprint-Analyse 7. Immunhistochemie 8. In-situ-Hybridisierung 9. FRET 10. Durchflusszytometrie 11. Facs

5 1. Molekulare Klonierung a. Restriktionsendonukleasen b. DNA-Ligasen c. Plasmidvektoren d. Klonierung durch Restriktion/Ligation e. Weitere Enzyme

6 Restriktionsendonukleasen 1

7 Restriktionsendonukleasen 1 VOR DEM SCHNITT NACH DEM SCHNITT 5 überhängendes Ende (z. B. EcoRI) 3 überhängendes Ende (z. B. KpnI) gerades Ende (z. B. SmaI) RESTRIKTIONS-MODIFIKATIONSSYSTEM EcoRI Methylase EcoRI schneidet nicht

8 DNA-Ligase 2 Ein DNA-Molekül Zwei DNA-Moleküle DNA-Ligase DNA-Ligase

9 Plasmide 3 1. Kleine Plasmide mit grosser Kopienzahl 1. Fertilitätsfaktoren 2. Resistenzfaktorenk 3. Virulenzfaktoren 2. Grosse Plasmide mit kleiner Kopienzahl

10 Plasmidvektoren 3 multiple Klonierungsstelle

11 Plasmidvektoren 3 Plasmidvektor Rekombinantes Plasmid

12 Molekulare Klonierung 4 Originale DNA-Moleküle: EcoRI Stelle EcoRI Stelle EcoRI Enzym Rekombinantes DNA-Molekül: Ligase

13 Molekulare Klonierung 4 Plasmidvektor DNA-Fragment Rekombinantes Plasmid Herstellung von einem rekombinanten Plasmid durch Ligation Transformation (in Bakterienzellen) Multiplizierung in der Zelle Multiplizierung der Bakterienzellen Eine Kolonie stammt aus einer einzigen Zelle

14 LacZ Gen - X-Gal chromogenes Substrat 4 DNA P rep laci C E O lacz lacy laca T DNA Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator IPTG indoxyl Galactose X-Gal

15 LacZ Gen 4 - X-Gal chromogenes Substrat DNA P rep laci C E O lacz lacy laca T DNA Repressor CAP site pol binding site Operator Strukturgene Terminator pol -gal permease transacetylase

16 lacz Gen in Klonierung 4 DNA lacz DNA Repressor CAP-Stelle pol-bindestele Operator Strukturgene Terminator lacz -Fragment fremde DNA lacz lacz

17 Andere Enzyme in Klonierung 5 EcoRI Schnitt - Klenow-Fragment - S1 Nuklease - Alkalische Phosphatasen Dephosphorylierung

18 2. PCR: Polymerase Chain Reaction Polymerase-Kettenreaktion Forward Primer Reverse Primer Denaturation Annealing Synthese Kary Mullis 1. Zyklus 2. Zyklus 3. Zyklus In vitro Methode zur Vervielfältigung (Amplifizierung) von DNA

19 PCR Nötig für die PCR: 1. DNA-Template 2. DNA-Polymerase 3. Zwei Primer 4. dntps 5. Puffer 6 Denaturation (2 DNA Stränge trennen sich) Erhitzen auf ºC Annealing (Primer bindet einzelsträngige DNAs) Abkühlen auf ºC Synthese (DNA-Polymerase bildet neuen DNA- Strang ab den Primer) Erhitzen auf ºC Menge der DNA wird in jedem Zyklus verdoppelt (unter optimalen Umständen) Primer neue DNA alte DNA theoretisch: exponentieller Anstieg der gewünschten DNA praktisch: Plateau-Phase

20 3. Gelelektrophorese 7 a. Agarose Gelelektrophorese b. Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) DNA-Fragmente sind negativ geladen, dafür wandern Sie in einem elektrischen Feld von der Katode in die Richtung der Anode

21 Agarose Gelelektrophorese 7 Auftragpuffer: Probe ist in einer Glycerollösung mit einem Farbstoff (z.b. Bromphenolblau) Laufphasen Molekulargewichtmarker

22 Agarose Gelelektrophorese 7 Transilluminator horizontal Färbung mit Ethidium-Bromide DNA-Banden fluoreszieren Anwendung: Trennung von Nukleinsäuren mit einem gröβeren Molekulargewicht.

23 Polyacrylamid Gelelektrophorese 7 Anwendung: Trennung von Nukleinsäuren mit einem kleinen Molekulargewicht, Trennung von Proteinen (polymerisiertes Acrylamid) Molekulargewichtmarker 40 Nucleotid vertikal Gel 10 Nucleotid

24 SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese 2 Untereinheiten des Proteins gekoppelt durch Disulphidbrücke Protein aus einer Untereinheit 7 Negativ geladene SDS-Moleküle SDS: denaturiert die Proteine und maskiert ihre eigenen Ladungen.

25 4. Detektierung von Makromolekülen a. Southern Blot b. Northern Blot c. Western Blot d. Eastern Blot

26 Gelelektrophorese Southern Blot DNA Anwendung: für die Nachweis einer bestimmten DNA- Sequenz in einem komplexen DNA- Gemisch. 8 Restriktionsverdauung Nitrocellulosemembran Autoradiogram Filterpapier Nitrocellulose Gel Hybridisierung mit radioaktiv markierter Probe alkalische Lösung DNA-Transfer mit Hilfe von Kapillarkraft vom Gel auf die Nitrocellulose-Membran

27 Southern Blot 8 (A) DNA-Transfer vom Gel auf die Membran DNA- Marker verdaute DNA Papierhandtuch Nylonmembran Gel Agarosegel Puffer Nylonmembran (B) Hybridisierungsanalyse markierte DNA-Probe Nylonmembran Röntgenfilm hybridisierte Banden

28 Northern Blot 9 RNA- Zellen, Extrakt Geweben RNA Agarose Gelelektrophorese RNA- Marker Filterpapier RNA-Probe (Heterogenität der Moleküle) Blotten Nitrocellulose Gel Anwendung: z.b. für die Detektion der Expression eines Gens unter unterschiedlichen Umständen. Hybridisierung und Autoradiographie

29 Northern Blot 9 Zellen RNA-Extrakt Gelelektrophorese RNA-Probe Elektroblot Blotten, Northern-Hybridisierung, Autoradiographie Hybridisierung der DNA-Probe mit dem komplementären RNA-Molekül

30 Western Blot (A) Elektrophorese/Transfer Anwendung: für die Detektion von spezifischen Proteinen in einer Probe. (B) Antikörperreaktion 10 Elektrischer Strom Inkubation mit Antikörper-1: Ab 1 ( ) SDS-PAGE Membran (C) Farbreaktion Inkubation mit Enzym-gekoppeltem Antikörper: Ab 2 Zugeben des Substrats

31 5. Gelretardierungsanalyse 11 Anwendung: für die Detektion von DNA-Protein Wechselwirkungen Bestimmung, ob irgendeines Protein (z.b. Transkriptionsfaktor) zu einem gegebenen DNA-Abschnitt bindet. Restriktionsfragmente Restriktionsfragmente + Kernproteine DNA-Marker Retardierte Bande Prinzip: die mit Protein gebundene DNA wandert im Gel langsamer

32 6. Footprint-analyse 12 Anwendung: für die Detektion von DNA-Protein Wechselwirkungen am Ende markierte Restriktionsfragmente - Zellkernextrakt am Ende markierte Restriktionsfragmente + Zellkernextrakt DNA-bindendes Protein partielle DNA- Verdauung Footprint Gelelektrophorese, Autoradiographie Footprint

33 7. Immunhistochemie 13 - Immunfluoreszenz Anwendung: Bestimmung, in welchen Geweben das untersuchte Protein vorhanden ist, in welchem Kompartiment der Zelle es lokalisiert ist. anti-c Antikörper fluoreszierende Farbe Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege anti-c Primärantikörper aus Hase Zelloberflächenantigene Cytoplasmatische Antigene Zelloberflächenantigene Cytoplasmatische Antigene Zellkern Zellkern Cytoplasma Cytoplasma Direkte Methode Indirekte Methode

34 7. Immunhistochemie 13 - Immunperoxidase-Methoden - Peroxidase Diamino-Benzidin (in der Anwesenheit von Peroxid): brauner Ausschlag - Biotin Avidin Peroxidase anti-hase Antikörper (Sekundärantikörper) Peroxidase Peroxidase Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege anti-c Primärantikörper aus Hase anti-c Antikörper Zelloberflächenantigene Cytoplasmatische Antigene Zellkern Cytoplasma Indirekte Methode Biotin Peroxidase anti-hase Antikörper (Sekundärantikörper) anti-c Antikörper Peroxidase Peroxidase Avidin

35 7. Immunhistochemie 13 - Immunperoxidase-Methoden Rolle: Signalverstärkung ABC-Methode (ABC= Avidin-Biotin Komplex) 1 Proteinmolekül wird hier mit vielen Enzymen markiert, die eine viel intensivere Farbreaktion ermöglichen. Avidin Biotin Peroxidase anti-hase Antikörper (Sekundärantikörper) Primärantikörper Antigen

36 7. Immunhistochemie 13 - alkalische Phosphatase - Digoxigenin anti-digoxigenin alkalische Phosphatase - Substrat X-Phosphat wird gespaltet, was zu einer Farbreaktion führt (Indoxyl) alk. Phosphatase anti-hase Antikörper alkalische Phosphatase Anti-Hase Sekundärantikörper aus Ziege anti-c Primärantikörper aus Hase anti-c Antikörper Zelloberflächenantigene Cytoplasmatische Antigene alk. Phosphatase Zellkern alk. Phosphatase Cytoplasma anti-hase Antikörper anti-c Antikörper anti-c Antikörper

37 8. In-situ-Hybridisierung 14 Detektierung von DNA oder mrna Markierung der Probe: 1. radioaktiv (S 35 ) 2. nicht-radioaktiv - fluoreszent - enzymatisch radioaktiv Biotin fluoreszenter Farbstoff fluoreszent (FISH) Avidin enzymatisch Peroxidase Probe (DNA oder RNA) Streptavidin Biotin anti-dig Antikörper ZielDNA fluoreszenter Farbstoff Fluoreszenz anti-dig Antikörper DIG anti-dig Peroxidase DIG Probe ZielDNA

38 9. Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung 14 Metaphasechromosom sich teilende Zelle Objektglas DNA wird denaturiert Fluoreszente Markierung

39 9. FRET Fluorescence resonance energy transfer 15 Zyan fluoreszierendes Protein (CFP) Gelb fluoreszierendes Protein (GFP) Anregung mit UV- Licht Protein X Emission: blaues Licht Anregung mit blauem Licht FRET: Die Energie eines angeregten Fluoreszenzfarbstoffs wird auf einen zweiten Fluoreszenzfarbstoff strahlungsfrei übertragen. Emission: gelbes Licht Protein Y UV Licht keine Proteinwechselwirkung Blaues Licht UV Licht Proteinwechselwirkung Gelbes Licht Anwendung: Aufklärung von Signaltransduktionswegen

40 10. Durchflusszytometrie 16 Fluoreszente Farbstoffe, die an bestimmte Bestandteile der Zellen binden, oder fluoreszent markierte Antikörper können auch verwendet werden. PMT3 PM: Photomultiplier (Verstärkung der eingehenden Signale) PMT2 PMT1 Filter PMT4 zweifarbige Filter Probe Zellen werden einzeln durch eine Kapillare gesaugt, streuen einen Teil des Lichts Scatter Detektoren Laser Emission von optischen Signalen seitens der Zelle, wenn diese einen monochromatischen Laserstrahl passiert. Die Menge des gestreuten Lichts korreliert mit der Gröβe und Komplexität. Sortierung Anwendung: z.b. Diagnose von Läukemie, Trennung von Spermien mit X oder Y Chromosom

41 11. FACS Fluorescence activated cell sorting 17 Probe Hüllenflüssigkeit Rote Fluoreszenz Grüne Fluoreszenz Laser Füllkragen 90 Lichtwerfer (Granularität) Vorne Lichtwerfer (Grö e) Geeignet für die Auftrennung von biologisch heterogenen Zellpopulationen. Detektionsscheiben Sammelröhrchen