Doppelmarkierung im CISH Her2 und Topo2A

Transkript

1 Doppelmarkierung im CISH Her2 und Topo2A Sonja Urdl und Sigurd Lax Institut für Pathologie LKH Graz West

2 In Situ Hybridisierung (ISH) Molekularbiologische Methode, zum Nachweis einer bekannten Sequenz von Nukleinsäuren (RNA oder DNA), in Geweben, einzelnen Zellen oder auf Metaphase-Chromosomen Einsatz einer künstlich hergestellten Sonde mit komplementärer Nukleinsäuresequenz Diese wird an den nachzuweisenden Genabschnitt hybridisiert

3 FISH/CISH/SISH FISH: Fluoreszenz In Situ Hybridisierung Detektion mittels Fluorochrom CISH: Chromogen In Situ Hybridisierung Detektion mittels Chromogen wie bei Immunhistochemie SISH: Silber In Situ Hybridisierung Detektion mittels Versilberung

4 Topoisomerase IIα (Topo 2A) Gen: Top2A Protein: TopoIIα Lokalisiert auf Chromosom 17 in unmittelbarer Nachbarschaft zu Her2/neu Schlüsselrolle im DNA- Stoffwechsel (Vorbereitung der Transkription) Molekulares Target für Topo2 Inhibitoren Anthrazykline z.b. Epirubicin und Doxorubicin 17q21.1 Her2 17q21.3 TOP2A

5 Her2/neu Gen: Her2, erb-b2, c-erbb2, Her2/neu Protein: HER2 Lokalisiert auf Chromosom 17 in unmittelbarer Nachbarschaft zu Top2A Wachstumsrezeptor Molekulares Target für Herceptin (Trastuzumab) 17q21.1 Her2 17q21.3 TOP2A

6 Wozu Her2/neu ISH? Nachweis einer Genamplifikation Voraussetzung für Herceptintherapie Meist Anwendung in Kombination mit Immunhistochemie (A, D, USA) Untersuchung aller Fälle mit immunhistochemischem Score 2+ Qualitätssicherung für Her2/neu Immunhistochemie

7 Wozu Topo2A ISH? Nachweis von Amplifikation bzw. Deletion Verbessertes Ansprechen auf Chemotherapie (Anthrazykline) bei Top2A Amplifikation schlechte Übereinstimmung von Topo2A-ISH und -IHC, daher eher nur ISH eingesetzt Häufige aber nicht obligate Assoziation mit Her2/neu Amplifikation Top2A Alteration: möglicher prädiktiver und prognostischer Faktor

8 Dako DuoCISH TM Markiert werden Gen (Her2 bzw. Top2A) und Zentromer mit 2 verschiedenen Sonden chromogene Zweifarbendarstellung (rot und blau) jener Signale, die von Dako Texas-Red und FITC markierten FISH Sonden ausgehen Nachweis von Amplifikationen, Deletionen und Translokationen

9 Dako DuoCISH TM Tag 1 Tag 2 Tag X FISH Denaturierung & Hybridisierung CISH am Autostainer Auswertung 40x Hybridisierung von Texas- Red und FITC markierten FISH-Sonden Inkubation mit CISH Antikörpermix (Anti-Texas- Red/AP und Anti-FITC/HRP) Inkubation mit Red-, danach mit Blue-Chromogen-Lösung

10 Dako DuoCISH TM Protokoll: Tag 1 Reagenzienvorbereitung: Entparaffinierungsreihe frisch richten: 2x Xylol, je 1x Äthanol (96%, 85%, 70%) Pre-Treatment-Solution verdünnen (x20), in Wasserbad (98 C) einstellen Waschpuffer verdünnen (x20), RT Stringent Wash Buffer verdünnen (x20), bei 2-8 C aufbewahren (für den 2. Tag) Hybridizer auf 37 C einstellen

11 Dako DuoCISH TM Protokoll: Tag 1 Entparaffinierung und Rehydrierung Vorbehandlung im Wasserbad (95-99 C): 10 min. Enzymatische Vorbehandlung mit Pepsin: 2 min. Dehydrierung: Ethanol (70%, 85%, 96%) Aufbringen der Her2/CEN-17 bzw. TOP2A/CEN-17 Sonden Denaturierung und Hybridisierung im Hybridizer

12 Dako DuoCISH TM Protokoll: Tag 2 Reagenzienvorbereitung: Stringent Wash Buffer: 1 Küvette ins Wasserbad (66 C) stellen, 1 Küvette bei RT belassen Waschpuffer S3006 für Autostainer verdünnen (10x) Blue-Chromogen-Lösung richten Hematoxylin S3301 verdünnen (10x) Achtung: Red-Chromogen-Lösung erst unmittelbar vor Gebrauch richten

13 Dako DuoCISH TM Protokoll: Tag 2 Stringentes Waschen Schnitte in stringentem Waschpuffer bei RT einstellen Deckgläser schwimmen ab Schnitte in stringentem Waschpuffer bei 65 C 10 min. inkubieren Autostainer Färbelauf Trocknen im Hybridizer: 37 C, 30 min. Eindeckeln

14 Auszählung im Lichtmikroskop 20 Zellkerne aus eindeutigen Tumorbereichen Bestimmung der Ratio: Her2/CEN-17 oder Top2A/CEN-17 Ratio 2,2: Amplifikation Ratio 1,8: keine Amplifikation Cut-off-Wert 1,8 2,2: Auszählung weiterer 20 Zellkerne

15 Her2/neu

16 Topo2A

17 Topo2A

18 Richtlinien für die Auszählung im Genamplifikationsassay Keine Zählung. Zellkerne überlappen, nicht alle Zellkernbereiche sind sichtbar. Es werden 3 blaue und 12 rote Signale gezählt (Schätzung bei Cluster) Es werden 2 blaue Signale und 1 rotes Signal gezählt. Signale, die mehr als einen Entstehungspunkt haben, werden als zwei Signale gezählt. Keine Zählung (zu stark angedaute Zellkerne) Es werden 2 blaue und 5 rote Signale gezählt. Signale, die mehr als einen Entstehungspunkt haben, werden als zwei Signale gezählt. Es werden 1 blaues Signal und 5 rote Signale gezählt. Es werden 3 blaue Signale (1 blaues ist unscharf) und 3 rote Signale gezählt. Ein Cluster von roten Signalen, die blauen Signale überdecken. Eine höhere Vergrößerung einstellen, um das Vorhandensein oder Fehlen von blauen Signalen zu bestätigen. Falls Zweifel bestehen, nicht mitzählen.

19 Vergleich FISH und CISH FISH Goldstandard, Grundlage für klinisches Management Lagerung der OT im Dunkeln bei -20 C Abdunkeln des Arbeitsplatzes beim Arbeiten mit dem Sondenmix und DAPI Fluoreszenzmikroskop Morphologie: verändert gegenüber HE, Orientierung eingeschränkt Gute Einzelsignalauswertung (Filter) Standardisierte Auswertung (CAP) CISH Neue Methode, keine klinischen Daten Lagerung der OT bei RT Kein Abdunkeln des Arbeitsplatzes Lichtmikroskop Gut erhaltene Morphologie gute Orientierung im Präparat Große, sich überlagernde Signale, werden nicht erkannt Auswertung wie FISH

20 Fazit Dako DuoCISH TM ist machbar und relativ einfach Aufwand (zeitlich/technisch) entspricht FISH Auswertung bequem (Lichtmikroskop) Problemlose Archivierung (wie IHC) Begrenzte Erfahrung betreffend Grenzfälle Zunehmende klinische Bedeutung von Topo2A

21 FIS(C)H und C(QU)IS(C)H(E) Vielen Dank für die Aufmerksamkeit!