Molekulare Verfahren im Kontext mit klinischer Praxis und Bestandsbetreuung beim Schwein

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1 Molekulare Verfahren im Kontext mit klinischer Praxis und Bestandsbetreuung beim Schwein DNA-Extraktion Photometrie Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Restriktionsanalyse Agarose-Gelelektrophorese Polyacrylamid-Gelelektrophorese DNA-Extraktion In-house Methoden Phenol/Chloroform-Extraktion NaJ-Methode GuSCN-Methode u.s.w. Kommerziell erhältliche Kits Blood Tissue Virale RNA Plant u.s.w. Kombination aus Kit- und in-house Methode

2 Eigenschaften der Probe Probenart Blut, Plasma, Serum, Sputum, Urin Kot, Tupfer, Organteile, etc. Probenvolumen Anteil an fremder Nukleinsäure z. B. Schweine-DNA Physikalische Eigenschaften der Probe Tupfer, Gewebe, Flüssigkeit, etc. Inhibitoren für die DNA-Polymerase DNA-Extraktion mit dem Viralen RNA Minikit 1. Lysieren der Probe mit AVL-Puffer zum Freisetzen der DNA/RNA Zentrifugationssäule 2. Binden der Proben-DNA/RNA an die Membran der Zentrifugationssäule 3. Zentrifugation 4. Waschen der gebundenen DNA/RNA mit Waschpuffer 1 Probenvolumen max. 630 µl 5. Zentrifugation 6. Waschen der gebundenen DNA/RNA mit Waschpuffer 2 DNA-bindende Membran 7. Eluieren der DNA/RNA mit Elutionspuffer Dauer der DNA/RNA-Extraktion: ca. 20 min

3 Photometrie Ultrospec 1100 pro Lambert-Beersches Gesetz: E = ε c d E Extinktion (E = -log(i 0 /I ) = -log T) ε molare Absorptionskoeffizient [l mol -1 cm -1 ] d Schichtdicke der Küvette [cm] c Konzentration [mol l -1 ] Konzentration: c = E / (ε d) Extinktionswerte optimal zwischen 0,1 und 1 (linearer Bereich) Absorption Konzentration von Nukleinsäuren (E 260 = 1): dsdna: 50 ng/µl ssrna: 40 ng/µl Wellenlänge in nm Qualität von Nukleinsäuren: dsdna: E 260 /E 280 1,8 Polymerase-Kettenreaktion Polymerase Chain Reaction P C R

4 PCR-Reaktionskomponenten Reaktionspuffer DNA-Polymerase (thermostabil) 4 Desoxynukleosidtriphosphate (dntps) A, G, C und T 2 Oligonukleotide (Primer): Länge Basen Magnesiumchlorid DNA- bzw. RNA-haltige Probe PCR-Zyklus 1. Schritt: Denaturierung der Ziel-DNA 2. Schritt: Annealing (Anheften) der Primer 3. Schritt: Extension (Verlängerung) der Primer Schritt = ein Zyklus

5 PCR-Reaktionsablauf Film ab! Pcr.exe Thermocycler

6 PCR-Qualitätskontrolle (1) Separate Räume oder Bereiche für jeden Schritt der PCR Vermeiden von direkten Verbindungen zwischen den Räumen Keine Luftzirkulation von Post-PCR-Räumen zu Prä-PCR-Räumen Zugangsregelung PCR-Qualitätskontrolle (2) feste Ausstattung für jeden Raum Handschuhe tragen und regelmäßig wechseln zum Pipettieren der Probe (DNA/RNA) gestopfte Spitzen benutzen PCR- Master-Mix ansetzen und aliquotieren Negativkontrollen und Positivkontrollen mitführen Interne Kontrollen mitführen (Inhibitorkontrollen)

7 PCR-Techniken Heiß-Start (Hot-Start)-PCR Nested-PCR Touchdown-PCR Multiplex-PCR RT-PCR (Reverse Transkriptase-PCR) Nested PCR

8 Touch-Down PCR Aktivierung der DNA-Polymerase (Hot-Start) Denaturierung Annealing Extension Denaturierung Annealing Extension 95 C, 15 min 95 C, 30 s 65 C, 90 s 72 C, 60 s 95 C, 30 s 55 C, 90 s 72 C, 60 s 10 x (- 1 C pro Zyklus) 30 x Multiplex-PCR Beispiel: Gleichzeitiger Nachweis von B. hyodysenteriae und L. intracellularis In dem PCR-Ansatz befinden sich zwei spezifische Primerpaare für B. hyodysenteriae und L. intracellularis Voraussetzung: beide Primerpaare haben ähnliche Annealingtemperaturen

9 (Reverse Transkriptase) RT-PCR Ausgangs-Nukleinsäure: RNA 1. Schritt: Umschreiben der RNA in DNA (Reverse Transkription) Bezeichnung der umgeschriebenen DNA: cdna (copy DNA) 2. Schritt: PCR mit der umgeschriebenen DNA als Ziel-DNA 1. und 2. Schritt kombiniert: One-Step RT-PCR Restriktionsanalyse Restriktionsenzym (Restriktionsendonuklease) = Enzyme, die die DNA an spezifischen Erkennungssequenzen schneiden Enzym Quelle Erkennungssequenz Schnitt Enden XbaI Xanthomonas badrii 5 -TCTAGA-3 5 -T CTAGA-3 5 -Überhang 3 -AGATCT-5 3 -AGATC T-5 SmaI Serratia marcescens 5 -CCCGGG-3 5 -CCC GGG-3 kein Überhang 3 -GGGCCC-5 3 -GGG CCC-5 PvuI Proteus vulgaris 5 -CGATCG-3 5 -CGAT CG-3 3 -Überhang 3 -GCTAGC-5 3 -GC TAGC-5

10 Beispiel: Restriktionsverdau mit XbaI 5 -GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCATCTAGAATGATAGCACTGG-3 3 -CCGACACCGGAAATAATGTTTCAACAGTAGATCTTACTATCGTGACC-5 XbaI, 37 C, 1 h 5 -GGCTGTGGCCTTTATTACAAAGTTGTCAT-3 3 -CCGACACCGGAAATAATGTTTCAACAGTAGATC CTAGAATGATAGCACTGG-3 3 -TTACTATCGTGACC-5 Agarose-GelElektrophorese (AGE) (Submarine Gelelektophorese)

11 Elektrophoresekammer Kamm Zähne Schlitten Endbegrenzer Größentrennung von DNA-Fragmenten bei verschiedenen Agarosekonzentrationen Agarosekonzentration (in %) Auftrennungsbereich linearer, dsdna in Bp 0, , , , , , , Elektrophoresepuffer: Spannung: Laufzeit: Färbung: TAE (Tris/Acetat/EDTA)- oder TBE (Tris/Borat/EDTA) Puffer 1-10 V/cm min Ethidiumbromid (kanzerogen!)

12 Bildanalyse Multiplex-PCR - B. hyodysenteriae (Bhyo) - L. intracellularis (Li) B. pilosicoli M IK* Bhyo Li * Interne Kontrolle

13 PolyAcrylamid-GelElektrophorese (PAGE) Reagenzien - Harnstoff (denaturierend) - Acrylamid (lineares Polymer) - Bisacrylamid (Vernetzer) - Puffer - Ammoniumperoxodisulfat (APS) - Tetramethylethylendiamin (TEMED) Auftrennung von Oligonukleotiden in denaturierenden Polyacrylamidgelen Acrylamidkonzentration (in %) Auftrennungsbereich (Nukleotide) , , Elektrophoresepuffer: Spannung: Stromstärke: Leistung: Laufzeit: TBE (Tris/Borat/EDTA) Puffer 1500 V 40 ma 40 W 1 2 h