Die Diagnostik der Koi-Herpesvirus-Infektion

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1 Die Diagnostik der Koi-Herpesvirus-Infektion Sven M. Bergmann und Dieter Fichtner Institut für Infektionsmedizin Nationales Referenzlabor für Fischkrankheiten Verbreitung der Infektion mit dem KHV Klinisches Bild Diagnostische Möglichkeiten (PCR, EM, IFA, IHC, ISH, Kryo) Empfehlungen für die Diagnostik Weiterführende Arbeiten 1

2 Verbreitung der Infektion mit dem Koi-Herpesvirus ??? KHV virale DNA Kapsid Tegument lipidhaltige Hülle Glykoproteinprojektionen 2

3 DNA des KHV - doppelsträngiges, lineares DNA-Genom - ca kbp - wahrscheinlich zirkulär während latenter Infektion (CCV) - Latenz : latency-associated transcript (LAT s) Latenz des KHV - Virus dringt primär in eine Zelle ein (Enterozyt?) - Transport zu einem Makrophagen/Histiozyten (?) - Genom ist zirkulär angeordnet (?) - begrenzte Replikation, u.a. auf RNA-Ebene (LAT s) - Ausbruch der KHV-Infektion oder Übertragung auf empfängliche Tiere 3

4 Klinisches Bild KHV infizierter Koi 4

5 KHV infizierter Koi Tag 0 5

6 Tag 4 Tag 10 6

7 Diagnostische Möglichkeiten 7

8 PCR/RT-PCR ELMI/IEM Histologie IFA, IHC, ISH Fragemtgröße Zeitschrift Gene Referenz 484 bp DAO 48 (2002) DNA Polymerase Gilad et al.(2002) 362 bp 290 bp J. Fish Dis. (2002) Fragmente Gray et al. (2002) real-time TaqMan PCR DAO (2004) DNA Polymerase Gilad et al LAMP J.Fish Dis. (2004) TK Gunimaladevi et al. (2004) 109 bp J. Virol. (2004) Fragment Pikarsky et al. (2004) 517 bp (+2 weitere) J. Virol. (2005) Fragmente Hutoran et al. (2005) 408 bp Vet. Microbiol. (2005) DNA Polymerase Ishioka et al. (2005) 409 bp BMC Microbiology (2005) TK Bercovier et al. (2005) 392 bp (1) 263 bp (2) 766 bp 1500 bp 584 bp unveröffentlicht DNA Polymerase DNA Polymerase Haupthüllprotein Hüllglykoprotein Kapsidprotein Bergmann 8

9 PCR mit Primern zum Nachweis des KHV M M 484 bp 365 bp M 100 bp ladder 1 Gilad KHV primers + KHV 45 C 2 Gilad KHV primers + KHV 55 C 3 Gilad KHV primers + KHV 65 C 4 Gilad KHV primers + KHV-like 45 C 5 Gilad KHV primers + KHV-like 55 C 6 Gilad KHV primers + KHV-like 65 C 7 Gray KHV primers + KHV 45 C 8 Gray KHV primers + KHV 55 C 9 Gray KHV primers + KHV 65 C 10 Gray KHV primers + KHV-like 45 C 11 Gray KHV primers + KHV-like 55 C 12 Gray KHV primers + KHV-like 65 C Testung verschiedener Gene zum Nachweis von KHV (KHV-I, CCB) 1 M M M 12 DNA-Polymerase (Gilad/Riems) 484 bp 391 bp 263 bp DNA- Fragmente (Gray) 365 bp 290 bp DNA- Fragment (Kotler) 517 bp M 100 bp-marker (peqlab) 1 KHV-Gray 2F-2R neg. 2 KHV-F-R (Gilad) 3 KHV-1Fn-1Rn (Bergmann 1) 4 KHV-2Fn-2Rn (Bergmann 2) 5 KHV-Gray 1F-1R 6 KHV-Gray 2F-2R 7 KHV-J-F-R (Bergmann 3) 8 CNGV NH1-2 (Kotler) 9 KHV-F-R neg. (MM) 10 KHV-F-R neg. (t) 11 KHV-F-R neg. (prep.) 12 KHV-Gray 1F-1R neg. 9

10 RT-PCR zum Nachweis von KHV (Koi, 7 Tage nach i.p. Injektion) RT-PCR npcr M M 9 10 M M 100 bp-marker 1 Kiemen 2 Haut 3 Milz 4 Niere 5 Leber 6 Darm 7 Gehirn 8 Leukozyten 9 neg. Kontrolle 10 pos. Kontrolle(KHV-I) 11 neg. nested Kontrolle 12 pos. nested Kontrolle (KHV-I) 13 pos. Organpool vom Karpfen 14 neg. Organpool vom Karpfen ELMI/IEM 10

11 KHV vom Karpfen (Organmaterial) KHV-I im Elektronenmikroskop (CCB-Zellen) Foto Dr. H. Granzow 11

12 IEM KHV-I T 36 (Kaninchen-α-KHV) gold-labelled GAR 10 CCB-Zellen Foto Dr. H. Granzow IEM KHV-I mak 10A9 gold-labelled GAR 10 CCB-Zellen Foto Dr. H. Granzow 12

13 IEM KHV-I mak 11A4 gold-labelled GAR 10 CCB-Zellen Foto Dr. H. Granzow Indirekter Immunfluoreszenztest (iifa) - Kaninchen α-khv T 35, T 36 and α-cngv - 12 monoklonal α-khv Antikörper 13

14 CCB, 2 d p.i., KHV-I, T 35 (1 : 2000) CCB, 2 d p.i., KHV-I, T 36 (1 : 8000) iifa mit mak s gegen KHV-I (DF 14/02) mab 11A4, Cy3, CCB mab 10A9, Cy3, CCB mab 7H7, Cy3, CCB 14

15 IIFA an Koi-Leukozyten 7. Tag p.i. (T36, 1:10 000) i.p.-infektion Bad-Infektion Kontakt-infizierter Koi (IIFA mit Leukozyten, 30. Tag nach Zusetzen) T 36, 1:8000 mak 10A9, 1:10 15

16 Immunhistochemie (IHC), Immunfluoreszenz (IFA), in-situ Hybridisierung (ISH) am Organschnitt IHC Hämalaun-Gegenfärbung heterologes Serum (α-vhsv vom Kaninchen) 16

17 IHC, T 36, 1 : 8000 iifa, T 36, 1 :

18 Herstellung von DIG-Sonden M M 500 bp 484 bp 517 bp M 100 bp Marker (peqlab) 1 Gilad-Sonde 2 Bergmann- Sonde 1 3 Bergmann-Sonde 2 4 Kotler-Sonde 5 negative Testkontrolle (Kotler-PCR) 6 negativer Organpool (Gilad-PCR) 391 bp 263 bp ISH BBY-Gegenfärbung heterologe (VHSV) Sonde 40 x 18

19 Gilad (484 bp) Bergmann 1 (391 bp) Bergmann 2 (263 bp) Kotler (517 bp) ISH BBY-Gegenfärbung KHV-Sonde 19

20 Hämalaun-Gegenfärbung ISH BBY-Gegenfärbung KHV-Sonde (Koi-Leukozyten, 7. Tag nach i.p.-infektion) irreguläre Sonde KHVSonde 20

21 Latenznachweis 14 d p.i. 3 Mo p.i. 21

22 7 Mo p.i. 15 Mo p.i. A B neg. SPF-Karpfen symptomloser Überlebender 22

23 Schlussfolgerungen 1. KHV ist ein besonderes Herpesvirus 2. KHV-Nachweis ist vielfältig möglich (PCR, RT-PCR, IHC, IFA, IEM, IHS) 3. KHV-Latenz ist nachweisbar 4. KHV als lymphotropes Herpesvirus (?) Empfehlungen zur KHV-Diagnostik 1. Probennahme - 10 Tiere / Bestand - Milz, Niere, Kieme (vorher Niere, Kieme, Gehirn) - Pool a 5 Tiere (für Latenznachweis besser Einzeltier) - in Transportmedium (Serum und Antibiotika) - gekühlter Versand - Untersuchung/Extraktion innerhalb von h 23

24 Empfehlungen zur KHV-Diagnostik 2. Laboruntersuchung - PCR nach Gilad et al. (2002) und/oder Gray et al. (2002) - nested PCR (im negativen Fall, latent inf. Tiere) - Kultivierung in CCB- oder KF-1-Zellen - bei CPE, IFT (polyklonale As bzw. monoklonale Ak) Empfehlungen zur KHV-Diagnostik 3. Bestätigungsmethoden - nested PCR oder PCR zum Nachweis anderer KHV-Gene - iift, IHC oder ISH am Organschnitt (Paraffin, Kryo) - Sequenzierung der PCR-Amplifikate 24

25 Weiterführende Arbeiten zur KHV-Diagnostik Alternativmethoden - Verwendung von Leukozyten - Verwendung von Kiemenabstrichen - Antigen-ELISA (Leukozyten, Organe, Kot) - Antikörper-ELISA (Screeningtest) - Kultivierungsmethoden (Virus, Zelle) - Realtime PCR Danke D. Fichtner H. Granzow U. Fischer R. Riebe M. Dauber W. Fuchs M. Riechardt D. Schrudde G. Bräuer K. Böttcher B. Dresenkamp P. Martin R. Hoffmann M. El-Matbouli C. Memel D. Kleingeld O. Haenen O. Gilad R. Hedrick K. Way M. Kotler 25

26 Gesunde Kois und Karpfen Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit! 26