MutaREAL Cytomegalovirus real time PCR Kit

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1 MutaREAL Cytomegalovirus real time PCR Kit Screening Test für den Nachweis von humanen Cytomegaloviren (CMV) mittels real time PCR. KV KV Nur für Forschungszwecke Immundiagnostik AG, Stubenwald-Allee 8a, Bensheim, Germany Tel.: +49 (0)6251/ Fax: +49 (0)6251/

2 1. VERWENDUNGSZWECK Der MutaREAL Cytomegalovirus (CMV) Kit ist ein quantitativer Screening-Test zum Nachweis von Cytomegaloviren in klinischen Proben (Vollblut, Plasma, Urin, Respirationstraktproben, Amnionflüssigkeit, CSF [cerebrospinal fluid] und anderen Körperflüssigkeiten) basierend auf real time PCR Kapillarsystemen (z. B. LightCycler, Roche). 2. EINLEITUNG Humane Cytomegaloviren (HCMV) verursachen bei 2% aller Geburten kurz- oder langfristige Folgeerscheinungen, welche mit einem deutlichen Anstieg der Mortalitätsrate einhergehen. Sie stellen damit die am weitesten verbreitete kongenitale Infektion dar. Zudem ist HCMV eines der bedeutendsten opportunistischen Pathogene bei immungeschwächten Personen (z.b. bei Empfängern von Organtransplantaten). Die Detektion und Quantifizierung einer systemischen HCMV-Zirkulation ist somit unerlässlich für die Abschätzung des HCMV- Erkrankungs-Risikos bzw. für die Entscheidung über eine antivirale Therapie (und deren Monitoring). 3. TESTPRINZIP Der MutaREAL Cytomegalovirus (CMV) real time PCR Kit enthält spezifische Primer, Hybridisierungssonden und weitere Reagenzien für die Detektion von Cytomegalovirus-DNA in klinischen Proben. Der Assay nutzt eine thermostabile DNA-Polymerase, um mittels PCR (polymerase chain reaction) ein spezifisches virales Gen-Fragment zu amplifizieren. Gleichzeitig wird die Fragment-Spezifität durch real time Hybridisierung des entstandenen Amplikons mit spezifischen Sonden überprüft. Dies führt zu einer Fluoreszenz-Emmission, welche in der optischen Einheit des real time PCR-Systems gemessen wird. Klinische Proben (wie z.b. Vollblut, Plasma, Urin, Respirationstraktproben, CSF [cerebrospinal fluid], Amnionflüssigkeit etc.) können als Ausgangsmaterial zur DNA-Isolierung dienen und entsprechend für die Austestung mit MutaREAL Cytomegalovirus verwendet werden. Die Detektion der amplifizierten Cytomegalovirus-DNA wird bei einer Wellenlänge von 640 nm (für LightCycler im Fluorimeter-Kanal F2) durchgeführt. Zudem wird durch eine in jede Reaktion eingeschlossene interne Kontrolle, welche koamplifiziert und detektiert wird, eine mögliche PCR-Inhibition überprüft. Die Detektion der amplifizierten internen Kontrolle wird bei einer Wellenlänge von 705 nm (für LightCycler im Kanal F3) durchgeführt. Durch den Einsatz der im Kit enthaltenen externen Standards (positive Kontrollen 1-3) kann darüber hinaus auch eine Quantifizierung der in den Proben nachgewiesenen Cytomegalovirus-DNA vorgenommen werden. 2

3 4. KITBESTANDTEILE Jeder Testkit enthält Reagenzien zur Durchführung von 24 bzw. 96 Bestimmungen, sowie eine Gebrauchsanleitung. Ref. Reagenz Konfektion 24 Konfektion 96 Deckelfarbe A1a Enzym Mix 1x 4 µl 3x 4 µl blau A1b Enzym Puffer (mit dntp) 1x 60 µl 3x 60 µl blau A2 Primer und Sonden-Mix 1x 400 µl 3x 500 µl gelb A3 MgCl 2 (25 mm ) 1x 250 µl 1x 1 ml weiß A4a Positivkontrolle 1 (1x10 4 cop/µl) 1x 20 µl 1x 50 µl rot A4b Positivkontrolle 2 (1x10 3 cop/µl) 1x 20 µl 1x 50 µl rot A4c Positivkontrolle 3 (1x10 2 cop/µl) 1x 20 µl 1x 50 µl rot A5 Negativkontrolle 1x 200 µl 1x 200 µl grün 5. ERFORDERLICHE LABORGERÄTE UND HILFSMITTEL Benötigte Materialien - mitgeliefert: PCR Reagenzien für real time PCR Gebrauchsanweisung Benötigte Materialien - nicht mitgeliefert: Real time PCR-System (z.b. LightCycler Instrument, Roche) Real time PCR-Reaktionsgefäße (z.b. LightCycler Kapillaren, Roche) Tischzentrifuge (z.b. LightCycler Kapillar-Zentrifuge, Roche) Kryobehälter (z.b. LightCycler Cooling Block, Roche) Color Compensation Kit für das verwendete real time PCR-System DNA-Extraktion Kit Pipetten (0,5 200 µl) sterile Filterspitzen für Mikropipetten sterile Reaktionsgefäße 3

4 6. LAGERUNG UND HALTBARKEIT Alle Reagenzien (A1 bis A5) sollten bei < -20 C gelagert werden. Alle Reagenzien können bis zum Ablauf des (auf der Kit-Packung angegebenen) Verfalls-datum verwendet werden. Mehrfaches Auftauen/ Einfrieren der Reagenzien A1 (a, b), A2, A3, A4 (a, b, c) vermeiden. Arbeitsschritte zügig im LightCycler Colling Block (Roche) durchführen bzw. Reagenzien stets geeignet kühlen. Primer-/ Sonden Mix (A2) vor Lichtkontakt schützen. 7. HINWEISE UND VORSICHTSMAßNAHMEN Nur für Forschungszwecke. Dieser Test muss durch speziell geschultes Personal durchgeführt werden. Die klinischen Proben müssen als potentiell infektiöses Material angesehen und entsprechend auch entsorgt werden. Die Regeln der Good Laboratory Practice (GLP) müssen eingehalten werden. Testkit nach Ablauf des Verfallsdatums nicht mehr verwenden. AMPLIFIKATION Die PCR-Technologie ist sehr sensitiv, d.h. die Amplifikation eines einzelnen Moleküls generiert Millionen identischer Kopien. Diese Kopien können in Form von Aerosolen entweichen und sich auf Unterlagen festsetzen. Um eine Kontamination von Proben mit Amplifikaten aus vorausgegangenen Experimenten zu vermeiden, sollte in zwei (möglichst auch räumlich) von einander getrennten Bereichen gearbeitet werden und zwar: 1) Bereich, in dem die Proben vorbereitet und die Reagenzien angesetzt werden 2) Bereich für die Amplifikation und deren Detektion Pipetten, Reaktionsgefäße und andere Arbeitsmittel sollten nicht innerhalb der verschiedenen Arbeitsbereiche zirkulieren. Sterile Pipettenspitzen mit Filtereinsatz benutzen Für jeden Arbeitsplatz neue Handschuhe und Kittel benutzen Dekontaminieren Sie in regelmäßigen Abständen Ihre Pipetten und Laborbänke mit Dekontaminationslösung Vermeiden Sie Aerosolbildung 4

5 8. TESTDURCHFÜHRUNG Die gesamte Durchführung ist in folgende vier Schritte aufgeteilt: A) DNA-Extraktion B) Herstellung des gebrauchsfertigen Enzym Mix C) Amplifikation des DNA-Ausgangsmaterials und kombinierte Detektion der entstandenen DNA-Fragmente D) Interpretation der Ergebnisse mit Hilfe der Software des verwendeten real time PCR- Systems und den externen Standard-Werten A) DNA-EXTRAKTION 1) DNA-Extraktion (mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen DNA-Isolierungs-Kits): Die Isolierung genomischer DNA mit Hilfe eines kommerziell erhältlichen Kits kann aus klinischen Proben (Vollblut, Plasma, Urin, Respirationstraktproben, CSF [cerebrospinal fluid], Amnionflüssigkeit etc.) entsprechend den Angaben des Herstellers erfolgen. 2) Falls die real time PCR nicht sofort durchgeführt wird, sollte die extrahierte DNA bei -20 C aufbewahrt werden. B) VORBEREITUNG DES GEBRAUCHSFERTIGEN ENZYM-MIX 1) Ein Röhrchen des Enzym Mix (A1a) und ein Röhrchen des Enzym Puffers (A1b) kurz bei rpm abzentrifugieren, um die Lösungen am Gefäßboden zu sammeln. 2) Enzym Puffer (A1b) quantitativ (60 µl) zum Enzym Mix (A1a) zugeben. 3) Vorsichtig durch Auf- und Abpipettieren mischen (nicht vortexen!). Die nun vorliegende Lösung stellt den gebrauchsfertigen Enzym Mix dar. C) REAL TIME Cytomegalovirus PCR-PROTOKOLL Es ist ratsam, das gesamte Protokoll zu lesen, bevor mit der Durchführung begonnen wird. Der Ansatz einer Gesamtmenge an Master Mix für die jeweilige Anzahl an Proben und die entsprechenden Kontrollen sollte folgendermaßen erfolgen: 1) Die gebrauchsfertige Enzym Mix Menge für eine Reaktion mit der Anzahl (n) der durchzuführenden Reaktionen (inklusive Kontrollen A4a, A4b, A4c und A5) multiplizieren und zum Ausgleich der Pipettierungenauigkeit einen zusätzlichen (virtuellen) Ansatz berechnen. Mit allen weiteren Reagenzien in der gleichen Weise verfahren. 2) Reagenzien während der Arbeitsschritte stets geeignet kühlen! Reaktionsvolumen Master Mix Volumen 2 µl Enzym Mix (gebrauchsfertig) (A1a + b) 2 µl x (n+1) 13,6 µl Primer-/ Sonden Mix (A2) 13,6 µl x (n+1) 2,4 µl MgCl 2 (A3) 2,4 µl x (n+1) 5

6 Die folgenden Reagenzien in einem sterilen Reaktionsgefäß vorsichtig mischen (NICHT VORTEXEN!): gebrauchsfertigen Enzym Mix (A1a + A1b), Primer-/ Sonden Mix (A2) und MgCl 2 (A3). Diese Mischung stellt den Master Mix dar; diesen kurz in der Tischzentrifuge abzentrifugieren. 2) 18 µl des Master Mix mit einer Mikropipette und sterilen Filterspitzen in jede der benötigten real time PCR-Gefäße (z.b. LightCycler Kapillaren) pipettieren. 2 µl der Proben-DNA bzw. Positiv- und Negativ- Kontrollen (A4a, A4b, A4c und A5) zu den jeweilig korrespondierenden real time PCR-Gefäße zupipettieren (es empfiehlt sich zuerst die Negativ-Kontrolle zu pipettieren und alle Gefäße stets unverzüglich zu verschließen, um Kontaminationen zu vermeiden). Die real time PCR-Gefäße kurz in der Tischzentrifuge abzentrifugieren, um die Reagenzien am Gefäßboden zu sammeln (bei Verwendung des LightCycler eine Kapillar-Zentrifuge verwenden). Folgendes real time PCR Protokoll durchführen: 95 C für 10 min 95 C für 0 sec 45 cycles 55 C für 15 sec ramping time: 20 C/sec aqu. mode here: SINGLE 72 C für 15 sec 40 C für 30 sec D) PCR-ANALYSE UND INTERPRETATION DER ERGEBNISSE 1) Durchführung der real time PCR. 2) Definieren Sie die drei mitgelieferten Quantifizierungs-Standards (Positivkontrollen 1-3) im Sample Loading Screen als Standards und geben Sie die entsprechende Konzentrationen ein (bei Verwendung des LightCycler siehe LightCycler Operator s Manual, Version 3.5, Chapter B, 2.4. Sample Data Entry). Diese Standardkurve kann zur Quantifizierung in weiteren Experimenten genutzt werden, sofern ein Standard im aktuellen Durchgang mit eingeschlossen ist. Dafür muß die zuvor erhaltenen Standard- Kurve importiert werden (bei Verwendung des LightCycler siehe LightCycler Operator s Manual, Version 3.5, Chapter B, Quantification with an External Standard Curve). 3) Schalten Sie den Color Compensation- Filter des real time PCR-Analysesystems ein, welcher für die gleichzeitige Nutzung verschieden Farbstoff-markierter Hybridisierungssonden benötigt wird (bei Verwendung des LightCycler durch Aktivierung des Felds Choose CCC File). 4) Das Ergebnis der Cytomegalovirus - Quantifizierung wird bei einer Wellenlänge von 640 nm (bei LightCycler im Fluorimeterkanal F2/F1: 640nm - Denominator Kanal 530 nm) angezeigt; das der internen Kontrolle bei einer Wellenlänge von 705 nm (bei LightCycler im Fluorimeterkanal F3/F1: 705nm - Denominator Kanal 530 nm). 6

7 5) Folgende Resultate sind möglich: Bei einer Wellenlänge von 640 nm wird ein Signal detektiert. Das Ergebnis ist positiv: die Probe enthält Cytomegalovirus - DNA. In diesem Fall ist die Detektion eines Signals bei einer Wellenlänge von 705 nm nicht notwendig, da hohe Cytomegalovirus DNA- Konzentrationen zu einem verminderten bzw. fehlenden Fluoreszenz-Signal der internen Kontrolle führen kann (Kompetition). Bei einer Wellenlänge von 640 nm wird kein Signal detektiert, jedoch bei einer Wellenlänge von 705 nm (Signal der internen Kontrolle). Die Probe enthält keine Cytomegalovirus - DNA. Das detektierte Signal der internen Kontrolle schließt die Möglichkeit einer PCR- Inhibition aus. Weder bei einer Wellenlänge von 640 nm noch bei 705 nm wird ein Signal detektiert. Es kann keine diagnostische Aussage gemacht werden. Die PCR-Reaktion wurde inhibiert. PC 3 PC 2 PC 1 NC 7