Materialien und Methoden...16

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1 Inhaltsverzeichnis I. Einleitung Mitochondrien - Energielieferanten der eukaryontischen Zelle Die mitochondriale DNA-Replikation Transkriptionsabhängige mtdna-replikation Alternative Replikationsmechanismen in Hefe Hsp70-Systeme und DNA-Replikation Das Hsp70-System - ein Chaperonsystem Beteiligung von Hsp70-Systemen an DNA-Replikationsprozessen DnaJ und homologe Proteine Die J-Domäne Mdj1p - ein mitochondriales DnaJ-Protein in Saccharomyces cerevisiae Zielsetzung dieser Arbeit II. Materialien und Methoden Material Chemikalien Mikroorganismen Escherichia coli Saccharomyces cerevisiae Primer und Plasmide Primer Plasmide... 20

2 1.4. Puffer und Lösungen Enzyme und Proteine Nährmedien und Platten Geräte Standards und Kits Methoden Kultivierung von Mikroorganismen Kultivierung von Escherichia coli Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae Molekularbiologische Techniken Ethanolfällung Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli Isolierung von DNA aus Saccharomyces cerevisiae Bestimmung der DNA-Konzentration Spaltung von DNA mit Restriktionsendonukleasen Modifikation von DNA mit Klenow-Fragment Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Ligation von DNA-Fragmenten Agarose-Gelelektrophorese Isolierung von DNA aus Agarosegelen Ortsspezifische Mutagenese von Plasmid-DNA Sequenzierung von Plasmid-DNA Southern-Blot Isolierung von RNA aus Saccharomyces cerevisiae Northern-Blot Transformation von Mikroorganismen mit rekombinanter DNA Methoden der Zellbiologie... 35

3 Isolierung von Mitochondrien aus Saccharomyces cerevisiae Synthese mitochondrialer Vorläuferproteine in vitro Import von in vitro synthetisierten Vorläuferproteinen in Mitochondrien Markierung von mitochondrialen Translationsprodukten in vivo DAPI-Färbung Tetrazolium-Färbung Proteinchemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Coomassie-Färbung Western-Blot Immunologischer Nachweis immobilisierter Proteine auf Nitrocellulose-Membranen Autoradiographie Bestimmung der Proteinkonzentration nach Bradford III. Ergebnisse und Diskussion Suche nach Suppressoren in konditionalen MDJ1-Mutanten Komplementation von Mdj1p durch homologe DnaJ-Proteine Klonierung der DNAJ-Gene für den mitochondrialen Import Mitochondrialer Import von Mdj1p Konstruktion eines Vektors für die Expression in Saccharomyces cerevisiae Klonierung der DNAJ-Gene für die Expression in Saccharomyces cerevisiae Konstruktion der Komplementationsmutanten Expression und mitochondrialer Import homologer DnaJ-Proteine in Saccharomyces cerevisiae Komplementation von Mdj1p durch homologe DnaJ-Proteine Komplementation von Mdj1p durch N-terminale Fragmente von Mdj1p und DnaJ 59

4 2.9. Temperatursensitive MDJ1-Mutanten mit N-terminalem Fragment von Mdj1p Temperatursensitive MDJ1-Mutanten mit Sis1p Der Einfluß des Farnesylierungsmotivs auf die Funktionalität von Ydj1p Respiratorische Aktivität der Komplementationsmutanten Untersuchung der mitochondrialen DNA in den Komplementationsmutanten Anfärbung der mitochondrialen DNA mit DAPI Transformation von YTL3MSScj1 und YTL3MSSis1 mit einem MDJ1-Allel Analyse der mitochondrialen DNA im Southern-Blott Synthese mitochondrial kodierter Proteine in den Komplementationsmutanten Mitochondriale Transkription in den Komplementationsmutanten Mitochondriale Translation in den Komplementationsmutanten IV. Zusammenfassung und Ausblick...91 V. Literaturverzeichnis...93

5 Abkürzungen Abkürzungen Ac APS ADP (d)atp BSA CD cpm CTAB (d)ctp DAPI DEPC DMSO DTT Acetat Ammoniumperoxodisulfat Adenosindiphosphat (desoxy-) Adenosintriphosphat Rinderserumalbumin Circulardichroismus Impulse pro Minute Cetyltrimethylammoniumbromid (desoxy-) Cytidintriphosphat 4,6-Diamidino-2-phenylindol Diethylpyrocarbonat Dimethylsulfoxid Dithiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA ER G/F-Linker (d)gtp HEPES HPLC HSP IMAC IPTG MES MOPS Ethylendiamintetraessigsäure endoplasmatisches Retikulum glycin-/phenylalaninreicher Bereich in DnaJ-Proteinen (desoxy-) Guanosintriphosphat [4-(2-Hydroxyethyl)-piperazino]-ethansulfonsäure high performance liquid chromatography Hitzeschockprotein immobilisierte Metallaffinitätschromatographie Isopropyl-β-D-galactopyranosid 2-Morpholino-1-ethansulfonsäure 3-Morpholino-1-propansulfonsäure

6 Abkürzungen NTA N-terminales Fragment NMR OD λ p.a. PAGE PCR PEG PMSF POD rpm RT SDS Su9 Nitrilotriessigsäure Proteinfragment von DnaJ-Proteinen, das die J-Domäne und den G/F-Linker umfaßt Kernmagnetische Resonanz Optische Dichte bei der Wellenlänge λ pro analysi Polyacrylamidgelelektrophorese Polymerasekettenreaktion Polyethylenglycol Phenylmethyl-Sulfonylfluorid Meerrettich-Peroxidase Umdrehungen pro Minute Raumtemperatur Natriumdodecylsulfat Untereinheit 9 der F o -ATPase aus Neurospora crassa S. cerevisiae Saccharomyces cerevisiae ts TCA TEMED Tris TTC (d)ttp v w WT temperatursensitiv Trichloressigsäure N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin Tri(hydroxymethyl)-aminomethan 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid (desoxy-) Thymidintriphosphat Volumen Gewicht Wildtyp