Antioxidative Wirkungen von schwefelhaltigen Aminosäuren und bioaktiven Peptiden: Hämoxygenase-1 und Ferritin als Mediatoren.
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1 Antioxidative Wirkungen von schwefelhaltigen Aminosäuren und bioaktiven Peptiden: Hämoxygenase-1 und Ferritin als Mediatoren Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Naturwissenschaftlichen Fakultät I der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Frau Dipl.-Pharm. Kati Erdmann geb. 7. Januar 1979 in Lutherstadt-Wittenberg Gutachter: 1. Prof. Dr. Henning Schröder, Halle (Saale) 2. Prof. Dr. Wolfgang Sippl, Halle (Saale) 3. Prof. Dr. Sönke Behrends, Braunschweig Halle (Saale), 16. Oktober 2006 (Tag der Verteidigung) urn:nbn:de:gbv: [
2 Inhaltsverzeichnis 1 Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 4 1 EINLEITUNG Atherosklerose Atherogenese Reaktive Sauerstoffspezies und oxidativer Stress Endogene und exogene antioxidative Schutzmechanismen Sekundärprävention durch mediterrane Diät Schwefelhaltige Aminosäuren und deren Derivate L-Methionin S-Adenosylmethionin L-Cystein Bioaktive Peptide Vorkommen Wirkungen in biologischen Systemen Ausblick Das Hämoxygenase-1/Ferritin-System Die induzierbare Hämoxygenase (HO-1) Die HO-1 als protektives Protein Regulierung der HO Ferritin als antioxidatives Protein 20 2 PROBLEMSTELLUNG 22 3 MATERIAL UND METHODEN Zellkultur Western-Blot-Analyse Inkubationsprotokoll zur Western-Blot-Analyse Proteinbestimmung nach Bradford SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) Proteintransfer durch Western-Blot Detektion mit spezifischen Antikörpern Northern-Blot-Analyse Plasmidgewinnung und -isolierung DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen DNA-Gelelektrophorese und Fragmentisolierung Inkubationsprotokoll zur Northern-Blot-Analyse RNA-Isolierung RNA-Gelelektrophorese RNA-Fixierung auf Nylon-Membranen durch Vakuum-Blotting Markierung von DNA-Sonden mit 32 P-Desoxycytidin-Triphosphat Vor- und Haupthybridisierung 28
3 Inhaltsverzeichnis Detektion, Quantifizierung und Beladungskontrolle Genreporter-Assay Plasmidgewinnung und -isolierung Transfektion Inkubationsprotokoll zum Luciferase-Assay Probenaufarbeitung und Luciferase-Assay Bestimmung der Hämoxygenase-Aktivität Inkubationsprotokoll zur Aktivitätsmessung Probenaufarbeitung HO-Aktivitätsbestimmung Bestimmung freier Sauerstoffradikale Inkubationsprotokoll zur Sauerstoffradikalmessung Messung der Lucigenin-verstärkten Chemilumineszenz Material Puffer, Lösungen und Medien Puffer Lösungen Substanzlösungen Medien Statistik 36 4 ERGEBNISSE Induktion der HO-1 auf Proteinebene Konzentrationsabhängige Effekte auf die HO-1-Proteinexpression Zeitabhängige Effekte auf die HO-1-Proteinexpression Effekte der freien Aminosäuren L-Methionin und L-Tyrosin im mikromolaren Konzentrationsbereich Effekte von Captopril, Methionyl-Phenylalanin und Methionyl-Methionin im mikromolaren Konzentrationsbereich Zusammenfassung Induktion des Ferritinproteins Konzentrationsabhängige Induktion des Ferritinproteins Zeitabhängige Induktion des Ferritinproteins Zusammenfassung Induktion der HO-1 auf mrna-ebene Konzentrationsabhängige Induktion der HO-1-mRNA durch L-Cystein und S- Adenosylmethionin Zeitabhängige Induktion der HO-1-mRNA durch L-Cystein und S- Adenosylmethionin Zusammenfassung Stabilisierung der HO-1-mRNA Effekt von L-Methionin auf HO-1-mRNA-Stabilität Effekt von Methionyl-Tyrosin auf HO-1-mRNA-Stabilität Effekt von L-Cystein auf HO-1-mRNA-Stabilität 57
4 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung HO-1-Genregulation Einfluss von Sauerstoffradikalen Einfluss von NO-abhängigen Stoffwechselwegen Einfluss von cgmp-abhängigen Stoffwechselwegen Einfluss des Transkriptionsblockers Actinomycin D Einfluss des Translationsblockers Cycloheximid Zusammenfassung Genreporter-Assay Effekte am humanen HO-1-Promotor Effekte am Maus-HO-1-Promotor Zusammenfassung Bestimmung der HO-Aktivität Effekt von L-Methionin auf die HO-Aktivität Effekt von L-Cystein auf die HO-Aktivität Zusammenfassung Untersuchungen zur Cytoprotektion in einem Modell für oxidativen Stress Antioxidative Effekte von Aminosäuren und deren Derivaten in Endothelzellen Einfluss des HO-1-Metaboliten Bilirubin Einfluss eines Hämoxygenase-Inhibitors auf die antioxidative Wirkung der getesteten Substanzen Einfluss eines NO-Synthase-Inhibitors auf die antioxidative Wirkung der getesteten Substanzen Zusammenfassung 74 5 DISKUSSION 75 6 ZUSAMMENFASSUNG 86 7 LITERATURVERZEICHNIS 88 8 VERÖFFENTLICHUNGEN Originalarbeiten In Kurzform publizierte Vorträge und Poster (Abstracts) DANKSAGUNG 107 1
5 Abkürzungsverzeichnis 4 Abkürzungsverzeichnis ACE Angiotensin I-konvertierendes Enzym Act D Actinomycin D AMP Adenosinmonophosphat APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosintriphosphat bp Basenpaar(e) BSA Rinderserumalbumin BVR Biliverdinreduktase camp cyclisches Adenosin-3,5 -monophosphat cgmp cyclisches Guanosin-3,5 -monophosphat CHX Cycloheximid CO Kohlenstoffmonoxid CPPs Caseinophosphopeptide dctp Desoxycytidintriphosphat DEPC Diethylpyrocarbonat DTT Dithiothreitol DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure EDRF Endothelium derived relaxing factor EDTA Ethylendiamintetraacetat HO-1 Hämoxygenase-1 HSP Hitzeschockprotein kb Kilobase LB-Medium Luria-Broth-Medium LDL Low density lipoprotein L-NAME N G -Nitro-L-arginin-methylester L-NMMA N G -Monomethyl-L-arginin MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinasen Met-Met Methionyl-Methionin Met-Phe Methionyl-Phenylalanin Met-Tyr Methionyl-Tyrosin MOPS 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure NADPH Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat (reduzierte Form) NO Stickstoffmonoxid NOS NO-Synthase NSAIDs nichtsteroidale antiphlogistische Analgetika ODQ 1-H-(1,2,4)-Oxadiazol-(4,3a)quinoxalin-1-on PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung PLB Passive Lysis Buffer PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PP i Pyrophosphat PTIO 2-Phenyl-4,4,5,5-tetramethylimidazolin-1-oxyl-3-oxid RLU Relative light units RNA Ribonukleinsäure ROS reaktive Sauerstoffspezies rpm Rounds per minute SAM S-Adenosylmethionin SSC Natriumchlorid-Natriumcitrat-Lösung SDS Natriumlaurylsulfat SDS-PAGE Natriumlaurylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SEM Standard error of mean
6 Abkürzungsverzeichnis 5 SOD TAE TEMED Tris ZnBG Superoxiddismutase Tris-Acetat-EDTA-Puffer N,N,N,N -Tetramethyl-ethylendiamin Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Zink-Bisglykolporphyrin
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