INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1. EINLEITUNG 1 2. MATERIAL UND METHODEN

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1 I Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS I ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IV 1. EINLEITUNG 1 2. MATERIAL UND METHODEN Organismen und Vektoren Kultivierung und Lagerung von Escherichia coli Vollmedium für die Anzucht von E. coli-stämmen Zellanzucht Messung des Bakterienwachstums Arbeiten mit Nukleinsäuren Isolierung von Nukleinsäuren Standardtechniken für das Arbeiten mit Nukleinsäuren Auftrennung und Dokumentation von Nukleinsäuren Größenbestimmung von Nukleinsäuren Konzentrationsbestimmung von DNA Gewinnung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Reinigung von PCR-Produkten Spaltung, Dephosphorylierung und Ligation von DNA Phenolextraktion und Fällung von Nukleinsäuren Übertragung von DNA in Escherichia coli Hybridisierung von Nukleinsäuren Herstellung von Digoxigenin markierten DNA-Sonden Southern-Blot (Southern, 1975) Dot-Blot Koloniehybridisierung Detektion von Hybridsierungssignalen Wiederverwendung von Nylonmembranen DNA-Sequenzierung DNA-Sequenzierung am A.L.F. -Sequencer DNA-Sequenzierung am ABI-Sequencer Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Standardmäßig eingesetzte PCR Overlap extension-pcr Proteinchemische Methoden Proteinbestimmung (Bradford, 1976) Bestimmung der Enzymaktvität Denaturierende Polyacrylamid-Gelektrophorese (SDS-PAGE ) Anfärben von Proteinen Trocknen von Polyacrylamid-Gelen Umpuffern und Einengen von Proteinlösungen Chemische Modifikation von GrdD Massenspektrometrie Spektroskopische Methoden 22

2 II Zink-Analytik Heterologe Protein-Expression Zellanzucht, Induktion der Genexpression und Zellernte Native Reinigung von Strep-tag-Fusiosprotein Geräte und Chemikalien sowie Firmen EXPERIMENTE UND ERGEBNISSE Klonierung von grdd1 aus Eubacterium acidaminophilum Auswertung der Sequenzdaten Genanordnung Transkriptions- und Translationssignale Versuche zur Klonierung von grdd Vergleich der Sequenzen von GrdC und GrdD aus Eubacterium acidaminophilum Sequenzen von GrdC und GrdD anderer Organismen Vergleich der Sequenzen von GrdC Vergleich der Aminosäuresequenzen von GrdD Vergleich der Aminosäuresequenz der großen Untereinheit GrdC von Protein C mit Sequenzen der Datenbanken Vergleich der Sequenz von GrdD mit Datenbanken Sequenzverleich von OrfU Heterologe Hybridisierung von chromosomaler DNA aus Clostridium litorale Klonierung von grdc und grdd in Vektoren zur heterologen Proteinexpression Klonierung von grdd in pqe30 in Escherichia coli M15 (prep4) Klonierung von grdd und grdc zur Expression als Strep-tag-Fusionsproteine In vitro-mutagenese von grdd Heterologe Expression der rekombinanten Untereinheiten von Protein C in Escherichia coli Reinigung von GrdD als N-terminales 6xHis-tag -Fusionsprotein Heterologe Expression von GrdD als Strep-tag-Fusionsprotein Reinigung von GrdC als Strep-tag-Fusionsprotein Enzymaktivität der Untereinheiten GrdD in Gegenwart von GrdC Enzymaktivität von GrdD-Mutanten Analyse des Zink-Gehalts in GrdC Untersuchungen zur Markierung des katalytisch aktiven Cysteins in GrdD Untersuchungen zum Substratschutz durch Acetylphosphat und zur Inaktivierung von GrdD durch Jodacetat Weiterführung der Ansätze durch Markierung von GrdD mit 4-Vinylpyridin und Analyse der proteolytischen Spaltungsprodukte Untersuchung der modifizierten Proteine und der Mutante GrdD C359 A durch CD-Spektroskopie DISKUSSION Protein C der Glycin-Reduktase Klonierung von grdd aus Eubacterium acidaminophilum Vergleich der funktionellen Genorganisation der Glycin-Reduktase und Proteine aus verschiedenen Organismen 71

3 III 4.4. Der Sequenzvergleich der Untereinheit GrdD Sequenzvergleich der Untereinheit GrdC Reinigung und Charakterisierung der rekombinanten Untereinheiten von Protein C nach heterologer Expression in Escherichia coli Die Rolle von Zink im Katalysemechanismus von Protein C Nachweis der katalytisch aktiven Thiol-Gruppe an GrdD Hypothetischer Mechanismus für die Katalyse von Protein C orfu aus Eubacterium acidaminophilum und Clostridium difficile ZUSAMMENFASSUNG LITERATURVERZEICHNIS 97

4 IV Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung AcP Acetylphosphat Amp r Ampicillinressistenz Ähnl. Ähnlichkeit AP- alkalische Phosphatase APS Ammoniumpersulfat ATP Adenosin-5 -triphosphat B. Bacillus Bet Betain (N,N,N-Trimethylglycin) bp Basenpaar(e) bzw. beziehungsweise C Grad Celsius C. Clostridium Ct. Carboxydothermus ca. circa CD Cirkulardichronismus CoA Coenzym A d Schichtdicke Da Dalton deg x cm2 x dmol Einheit der molaren Eliptizität dest. destilliert DNA Desoxyribonukleinsäure DNase Desoxyribonuclease dntp Desoxynucleosid-5 -triphosphat DTT Dithiothreitol DIG Digoxigenin dutp Desoxyuridin-5 -triphosphat ε molarer Extinktionskoeffizient E. Eubacterium, Escherichia EDTA Ethylendiamintetraessigsäure EB Elutionspuffer Endkonz. Endkonzentration Fa. Firma F Farad FAD Flavinadenindinucleotid g Gramm h Stunden HABA 4-Hydroxyazobenzene-2-carboxylic acid HPLC High-performance liquid chromatography Ident. Identität IPTG Isopropyl-β-thiogalactopyranosid J Joule k- kilo- (10 3 ) kb kilobasen K M Michelis-Konstante l Liter λ Lambda (Wellenlänge) M Molar M- mega- (10 6 )

5 V -m -meter m- milli (10-3 ) µ- micro- (10-6 ) min Minute(n) mrna messenger-ribonukleinsäure m/z Massenzahl N normal n- nano-(10-9 ) NAD(P) + Nicotinamidadenindinucleotid-(phosphat) NAD(P)H Nicotinamidadenindinucleotid-(phosphat) reduziert OD Optische Dichte orf open reading frame (offener Leserahmen) PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese P i anorganisches Phosphat ph negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration PCR Polymerase-Ketten-Reaktion PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuclease rdna ribosomale Desoxyribonukleinsäure s Sekunde(n) s. siehe Sar Sarkosin (N-Methyl-Glycin) SDS Natriumdodecylsulfat s. o. siehe oben Tab. Tabelle TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin TFA Trifluoressigsäure theoret. theoretisch Tris Tris(hydroxymethyl)aminomethan T. Tissierella, Treponema u. a. unter anderem U Units (Einheit für die Enzymaktivität) upm Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett V Volt Vol. Volumen v/v Volumen pro Volumen w/v Gewicht pro Volumen X-Gal 5-Brom-4-chlor-indoyl-β-D-galactosid z. B. zum Beispiel