Untersuchungen zum Einfluss von Polyalaninsequenzen auf die Bildung amyloider Fibrillen von PABPN1

Transkript

1 Untersuchungen zum Einfluss von Polyalaninsequenzen auf die Bildung amyloider Fibrillen von PABPN1 Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Till Scheuermann geb in Freiburg im Breisgau urn:nbn:de:gbv: [

2 Gutachter: 1. Prof. Dr. R. Rudolph 2. Prof. Dr. U. Baumann 3. Prof. Dr. E. Wahle Verteidigt am 6. November 2003

3 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Trinukleotidexpansionen als Ursache genetisch bedingter Krankheiten Okulopharyngeale Muskeldystrophy (OPMD) Das nukleäre Poly(A)-Bindungsprotein 1 (PABPN1) Polyalaninsequenzen in der Natur Intranukleäre fibrilläre Strukturen im Fall der OPMD Strukturelle Eigenschaften von amyloiden Fibrillen Problemstellung Materialien und Methoden Materialien Chemikalien Standards Proteine, Enzyme und Peptide Säulenmaterialien Sonstige Materialien Geräte E. coli-stämme Primer und Plasmide Methoden DNA-Amplifikation mit PCR Ortsspezifische Mutagenese Konstruktion der Expressionsplasmide Anzucht von E. coli Schüttelkolbenanzucht Fed-Batch Fermentation Reinigung der überexprimierten Proteine Reinigung von PABPN1, PABPN1-(+7)Ala und PABPN1- Ala... 21

4 Reinigung von N-WT, N- Ala und N-(+7)Ala Reinigung der RNP-Domäne Reinigung der RNP-Domäne mit N-terminaler α-helix (α-rnp) Konzentrierung von Proteinlösungen Lyophilisation von Proteinlösungen Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen N-terminale Sequenzanalyse Massenspektrometrie Fluoreszenzspektroskopie Chemisch induzierte Entfaltungs- und Rückfaltungsübergänge Detektion amyloider Fibrillen durch ThT- und ANS-Fluoreszenzmessungen Analytische Ultrazentrifugation Circulardichroismus Oberflächenplasmonresonanz Proteinkristallisation Bromcyanspaltung von N-(+7)Ala Elektronenmikroskopie Präparation von seeds Kongorotfärbung FT-IR-Spektroskopie Ergebnisse Charakterisierung von PABPN Expression und Reinigung von PABPN Spektrale Eigenschaften von PABPN Thermische und chemische Stabilität Limitierte Proteolyse von PABPN Untersuchungen einzelner Domänen von PABPN Expression und Reinigung der N-terminalen Domäne (N-WT) Charakterisierung von gereinigtem N-WT Expression und Reinigung von RNP und α-rnp Charakterisierung von RNP und α-rnp mittels Fern-UV-CD-Spektroskopie Untersuchungen zur Oligomerisierung von RNP und α-rnp... 43

5 Wechselwirkung der RNP-Domäne mit ssrna Stabilität der RNP-Domäne gegenüber chemischen Denaturierungsmitteln Kristallisation einzelner Domänen zur Aufklärung der 3D-Struktur Untersuchungen zum Einfluss der Alaninexpansion und Alanindeletion auf PABPN Expression und Reinigung von PABPN1-(+7)Ala und PABPN1- Ala Untersuchungen zur Struktur und Stabilität von PABPN1-(+7)Ala und PABPN1- Ala Untersuchungen zum Einfluss der Alaninexpansion und Alanindeletion auf die N-terminale Domäne von PABPN Expression und Reinigung von N-(+7)Ala und N- Ala Strukturelle Charakterisierung von N-(+7)Ala und N- Ala Untersuchung zur Fibrillenbildung der N-terminalen Domänen Einfluss des His-tags auf die Fibrillenbildung von N-(+7)Ala Bromcyanspaltung von N-(+7)Ala Fibrillenbildung von N-(+7)Ala ohne His-tag Charakterisierung der Fibrillen der N-terminalen Domäne Bindung von Kongorot an Fibrillen der N-terminalen Domäne N-(+7)Ala Untersuchung der Fibrillen von N-(+7)Ala und N-WT mittels FT-IR- Spektroskopie Ermittlung der Sekundärstrukturanteile mittels Fern-UV-CD-Spektroskopie Röntgenbeugung von Filamenten aus N-(+7)Ala Resistenz der Fibrillen gegenüber chemischen Reagenzien und Proteinase K Kinetische Untersuchungen zur Fibrillenbildung Nachweis von Fibrillen der N-terminalen Domäne mit ANS Konzentrationsabhängigkeit der Fibrillenbildung Induktion der Fibrillierung durch die Zugabe von seeds Induzierte Fibrillierung von N-(+7)Ala Einfluss der seed-konzentration auf das Fibrillenwachstum mit N-(+7)Ala Einfluss der Proteinkonzentration auf das Fibrillenwachstum Vergleich der initialen Wachstumsraten von N-WT, N-(+7)Ala und N- Ala Unterdrückung der Fibrillierung durch Trifluorethanol...76

6 4 Diskussion Strukturelle Charakterisierung von PABPN Einfluss der Polyalaninsequenz auf PABPN Fibrillenbildung der N-terminalen Domänen Strukturelle Charakterisierung der Fibrillen aus N-(+7)Ala und N- WT Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis...92

7 Abkürzungen und Begriffserklärungen Abkürzungen A 15 Einzelstrang RNA bestehend aus 15 Adenylatresten Aß-Peptid die ersten Aminosäuren des Amyloid-Vorläufeproteins ANS 1-Anilino-8-naphtalensulfonat APS Ammoniumperoxodisulfat BSA Rinderserumalbumin DTT 1,4-Dithiothreitol EDTA Ethylendiamintetraacetat EM Elektronenmikroskopie ESI Elektrospray-Ionisation HEPES 2-[4-(2-Hydroxyethyl)1-piperazinyl]-ethansulfonsäure HPSF High Purity Salt Free IPTG Isopropyl-ß-D-1-thiogalactopyranosid K D Gleichgewichts-Dissoziationskonstante MALDI Matrix Assisted Laser Desorption Ionisation MWCO Molecular Weight Cut Off MOPS 3-Morpholinopropansulfonsäure NTA Nitrilotri-Essigsäure N-WT N-terminale Domäne von PABPN1 N-(+7)Ala N-terminale Domäne von PABPN1-(+7)Ala N- Ala N-terminale Domäne von PABPN1- Ala OPMD Okulopharyngeale Muskeldystrophie PABPN1 nukleäres Poly(A)-Bindungsprotein 1 (Wildtyp) PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese PCR Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglycol PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid PVDF Polyvinylidenfluorid RNP Ribonukleoprotein RP-HPLC Reversed Phase-High Performance Liquid Chromatography rpm Umdrehungen pro Minute RRM eukaryotisches RNA-Erkennungsmotiv SDS Natriumdodecylsulfat ssrna Einzelstrang RNA TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin TFE Trifluorethanol ThT Thioflavin T Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan U Unit U1A Komponente des kleinen Kern-Ribonukleoproteinpartikel U1 UTR Untranslated Region v Volumen V t Säulenvolumen w Gewicht Xaa beliebige Aminosäure

8 Abkürzungen und Begriffserklärungen Begriffserklärungen Für die Beschreibung und Diskussion der Bildung fibrillärer Aggregate wurden folgende Begriffe verwendet: Fibrillierung Übergang von Proteinmolekülen vom löslichen Zustand in den unlöslichen fibrillierten Zustand, unabhängig von der Anwesenheit von seeds Fibrillenbildung Fibrillierung ohne die Zugabe von seeds Fibrillenwachstum Verlängerung von seeds durch die Fibrillierung von Proteinmolekülen; lagphase Inkubationszeit in der keine Fibrillierung nachgewiesen werden konnte Nukleationskeim erstes stabiles Oligomer bei der Fibrillenbildung seeds fragmentierte Fibrillen Wachstumsrate Fibrillenwachstum pro Zeiteinheit