Gewebe- und zellspezifische Lokalisation der Alkaloidbiosynthese in Papaver somniferum L.

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Gudrun Holzmann
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1 Gewebe- und zellspezifische Lokalisation der Alkaloidbiosynthese in Papaver somniferum L. Dissertation Zur Erlangung des akademischen Grades Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) vorgelegt der Mathematisch-Naturwissenschaftlich-Technischen Fakultät (mathematisch-naturwissenschaftlicher Bereich) der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Marion Weid geb. am in Heidenheim-Mergelstetten Gutachter: 1. Prof. Dr. T.M. Kutchan 2. Prof. Dr. J. Stöckigt 3. Prof. Dr. B. Dräger verteidigt am in Halle (Saale) urn:nbn:de:gbv: [

2 Meinem Mann und meinen Söhnen Jannik, Tobias und Maximilian

3 INHALTSVERZEICHNIS I Abkürzungsverzeichnis 1 1. Einleitung Alkaloide Alkaloide aus Papaver somniferum und deren Biosynthese Die Bedeutung der Milchröhren im Schlafmohn für die Alkaloidbiosynthese Phloem Lokalisationsstudien von Alkaloidbiosynthesen Zielstellung der Arbeit Material und Methoden Material Pflanzen Bakterienstämme Medien Vektoren Oligonukleotide Chemikalien und Enzyme Spezielle Chemikalien für die Zytologie Farbstoffe Antikörper Primäre Antikörper Sekundäre Antikörper Geräte Zentrifugen Mikroskope, Kameras und Microtom PCR-Geräte Sonstige Geräte Methoden DNA Isolierung von Plasmid-DNA Verdau von DNA mit Restriktionsenzymen Ligation von DNA Herstellung und Transformation kompetenter Escherichia coli-zellen Gelelektrophorese von DNA Fragmentisolierung aus Agarosegelen Polymerasekettenreaktion Sequenzierung RNA RNA Gele Proteine Proteinkonzentrationsbestimmung Proteinexpression in Bakterien Herstellung von Antikörpern Extraktion von Proteinen aus Mohngewebe Trennung von Proteinen über Polyacrylamidgele Elektroblotting von SDS-Gelen Western Blot Zytologische Methoden Lokalisation von Proteinen Einbettung in Polyethylenglykol Einbettung in Paraffin Poly-L-Lysinbeschichtung von Objektträgern Immunmarkierung von Polyethylenglykolschnitten Immunmarkierung von Paraplastschnitten Färbungen Zytologische Methoden Lokalisation von mrna RNA Markierung durch in vitro-transkription Dot Blot zur Quantifizierung von Digoxigenin markierten RNA Sonden 35

4 INHALTSVERZEICHNIS II Quantifizierung der Fluorescein-markierten RNA-Sonde In situ-hybridisierung Ergebnisse Anatomie der Papaver somniferum Leitbündel Major Latex Protein Sequenzierung des Major Latex Proteins und Sequenzvergleich Klonierung und heterologe Expression in Escherichia coli Western Blot Lokalisation der Milchröhren in der Kapsel Lokalisation der Milchröhren im Stängel Hydroxy-N-Methylcoclaurin-4 -O-Methyltransferase Heterologe Expression in Escherichia coli Western Blot Lokalisation in der Kapsel und im Stängel Salutaridinol-7-O-Acetyltransferase Klonierung und heterologe Expression in Escherichia coli Western Blot Lokalisation der Salutaridinol-7-O-Acetyltransferase in der Kapsel und im Stängel Vergleich der Lokalisation von 4 OMT und SalAT Lokalisation der Salutaridinol-7-O-Acetyltransferase in der Wurzel Codeinon-Reduktase Klonierung und heterologe Expression in Escherichia coli Western Blot Lokalisation der Codeinon-Reduktase in der Kapsel und im Stängel Lokalisation der Codeinon-Reduktase in der Wurzel Lokalisation der Codeinon-Reduktase-mRNA durch in situ-hybridisierung (R,S)-Retikulin 7-O-Methyltransferase Klonierung und heterologe Expression in Escherichia coli Western Blot Lokalisation der (R,S)-Retikulin-7-O-Methyltransferase in der Kapsel und im Stängel Lokalisation in der Wurzel Lokalisierung der 7OMT-mRNA durch in situ-hybridisierung Berberinbrückenenzym Western Blot Lokalisation in der Wurzel Diskussion Alkaloide biotechnologischer Zugang Ergebnisse der Lokalisation im Vergleich zu bisherigen Ergebnissen Untersuchung der Milchröhren Lokalisation der 3 -Hydroxy-N-Methylcoclaurin-4 -O-Methyltransferase Lokalisation der Codeinon-Reduktase Lokalisation der (R,S)-Retikulin-7-O-Methyltransferase Lokalisation des Berberinbrückenenzyms Bedeutung der räumlichen Aufteilung der Alkaloidbiosynthese Weiterführende Arbeiten Zusammenfassung Literaturverzeichnis 88

5 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 1 Abkürzungsverzeichnis A Adenin, Adenosin ATP Adenosintriphosphat BBE Berberinbrückenenzym BCIP 5-Bromo-4-Chlor-3-Indolylphosphat bp Basenpaare BSA Rinderserumalbumin C Cytosin, Cytidin C Grad Celsius CaMV Calciummosaikvirus cdna komplementäre DNA CjMDR1 Coptis japonica Multidrug-resistance-type Protein COR Codeinon-Reduktase cv Cultivar CYP80B1 (S)-N-Methyl-Coclaurin-3 -Hydroxylase DHS Desoxyhypusin- Synthase DNA Desoxyribonukleinsäure DOPA Dihydroxyphenylalanin EDTA Ethylendiamintetraessigsäure ER Endoplasmatisches Retikulum EST Expressed sequence tag g Gramm oder Erdbeschleunigung G Guanin, Guanosin H6H Hyoscyamin-6β-Hydroxylase His Histidin HS Homospermidin-Synthase IgG Immunglobulin G IPTG Isopropyl-1-thio-β-galactopyranosid kb Kilo-Basenpaare kda Kilo-Dalton M Mol MLP Major Latex Protein MOPS 3-[N-morpholino]propansulfonsäure mrna messenger RNA NADPH Nicotinamidadenindinukleotidphosphat NBT Nitroblautetrazolium 4 OMT (R,S)-3 -Hydroxy-N-Methylcoclaurin-4 -O-Methyltransferase 6OMT (S)-Norcoclaurin-6-O-Methyltransferase 7OMT (R,S)-Retikulin-7-O-Methyltransferase 9OMT (S)-Scoulerin-9-O-Methyltransferase ORCA Octadecanoid-Responsive Catharanthus AP2 PAGE Polyacrylamidelektrophorese PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerasekettenreaktion PEG Polyethylenglykol Pfu Pyrococcus furiosus PMT Putrescin-N-Methlytransferase RNA Ribonukleinsäure rpm Umdrehungen pro Minute Rubisco Ribulose-1,5-bisphosphat-Carboxylase/-Oxygenase

6 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 2 SalAT SDS sec STR T Taq TDC TDC TEMED Tris TYDC U UTP (v/v) (w/v) Salutaridinol-7-O-Acetyltransferase Natriumdodecylsulfat Sekunde Strictosidin-Synthase Thymin, Thymidin Thermus aquaticus Tryptophan-Decarboxylase Tryptophan-Decarboxylase N,N,N,N -Tetramethylethyldiamin Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan Tyrosin/Dopa-Decarboxylase Units Uridintriphosphat Volumen pro Volumen Gewicht pro Volumen

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