0ROHNXODUH&KDUDNWHULVLHUXQJXQG0XWDWLRQVDQDO\VH GHU)ULQJH*HQIDPLOLH/XQDWLF5DGLFDOXQG0DQLF)ULQJHEHL3UREDQGHQ PLWHLQHP$ODJLOOH6\QGURP
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- Leopold Busch
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1 Aus dem Institut für Humangenetik und Medizinische Biologie an der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg (Direktor: Prof. Dr. I. Hansmann) 0ROHNXODUH&KDUDNWHULVLHUXQJXQG0XWDWLRQVDQDO\VH GHU)ULQJH*HQIDPLOLH/XQDWLF5DGLFDOXQG0DQLF)ULQJHEHL3UREDQGHQ PLWHLQHP$ODJLOOH6\QGURP Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades Doktor der Medizin (Dr. med.) vorgelegt der Medizinischen Fakultät der Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg von Ursula Irmgard Böhm geboren am in Esslingen am Neckar Gutachter: Prof. P. Wieacker Prof. G. Horneff Prof. I. Hansmann verteidigt am urn:nbn:de:gbv: [
2 5HIHUDWXQGELEOLRJUDSKLVFKH%HVFKUHLEXQJ Das $ODJLOOH-Syndrom ($*6) betrifft etwa eines von Lebendgeborenen und gehört somit zu den häufigsten Ursachen für angeborene chronische Lebererkrankungen. Mutationen im Bereich des -$*-Gens sind ursächlich für die Entstehung des $*6. Doch nur 65-70% der Patienten mit $*6 besitzen nachweisbare Veränderungen innerhalb dieses Gens. Aus diesem Grund wird genetische Heterogenität diskutiert. -$* ist ein Bestandteil der sehr komplexen 1RWFK-Signalkaskade, welche essentiell für Differenzierungsprozesse während der Embryonalentwicklung ist. Die Wirkung des -$*- Proteins innerhalb der 1RWFK-Signalkaskade wird durch die Genprodukte der )ULQJH-Gene [/XQDWLF)ULQJH-Gen (/)1*), 0DQLF)ULQJH-Gen (0)1*) und 5DGLFDO)ULQJH-Gen (5)1*)] reguliert. Damit kommen die drei )ULQJH-Gene als Kandidatengene des $*6 in Betracht. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, einen möglichen Zusammenhang zwischen der Entstehung des $*6 und Mutationen im Bereich der drei )ULQJH-Gene zu untersuchen. Mittels LQVLOLFR Analysen, einem %$&-%DQN6FUHHQLQJ sowie Sequenzierungen wurden die Sequenzen der )ULQJH-Gene komplettiert sowie die genomische Struktur des /)1*V charakterisiert. Es wurde ein MutationsVFUHHQLQJ aller drei )ULQJH-Gene bei 38 Patienten mit $*6 ohne nachweisbare Mutationen im Bereich des -$*-Gens durchgeführt. Nicht untersucht wurden die Exons 1 und 8 des /)1*V sowie das Exon 1 des 5)1*V. Es konnten mittels 66&3-Analyse und anschließender Sequenzierung bei EDQG VKLIWV im 66&3-Lauf die folgende Polymorphismen identifiziert werden. Im /)1* c: cæt, c:433-78cæt, c:733-51cæa, c:733-36cæt, c:969gæa, c:985-53gæa, c:985-37gæa, im 5)1* c:460aæc, c:574-5cæt, c: gæa und im 0)1* c:648-56cæt. Es wurden keine pathogenen Mutationen innerhalb der untersuchten Exonbereiche bei Patienten mit $*6 nachgewiesen. Somit kann ein Zusammenhang zwischen Mutationen im Bereich der )ULQJH-Gene und der Entstehung des $*6 mit großer Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Böhm, Ursula Irmgard: Molekulare Charakterisierung und Mutationsanalyse der )ULQJH- Genfamilie /XQDWLF-, 5DGLFDO- und 0DQLF)ULQJH bei Probanden mit einem $ODJLOOH-Syndrom Halle, Martin-Luther-Univ., Med.Fak., Diss., 76 Seiten, 2004
3 Inhaltsverzeichnis (LQOHLWXQJ 1.1 Das $ODJLOOHSyndrom ($*6) Das 1RWFKSignalsystem Die 1RWFKProteine Der 1RWFKLigand -$* Das 1RWFKSignalsystem Die )ULQJHGen-Familie Fragestellung und Zielsetzung vorliegender Arbeit 9 0DWHULDOXQG0HWKRGHQ 1.1 Material Chemikalien Längenstandards Gebrauchswaren Geräte Puffer und Stammlösungen Nährböden und Medien Sterilisation von Lösungen und Geräten ULPHU Art und Herkunft der untersuchten DNA Art und Herkunft der %$&-Bank Methoden Isolierung genomischer DNA aus Blut Isolierung von %$&-DNA Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren mittels photometrischer 18 Bestimmung Horizontale Agarose-Gelelektrophorese Isolierung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen Polymerase Kettenreaktion (3&5) DNA-Sequenzierung Analyse von Einzelstrangkonformationspolymorphismen (VLQJOHVWUDQGHG 24 FRQIRUPDWLRQSRO\PRUSKLVP66&3) (UJHEQLVVH 3.1 Komplettierung der DNA-Sequenzen sowie Darstellung der genomischen 25 Struktur des humanen /XQDWLF)ULQJH-Gens Komplettierung von DNA- Sequenzen des /XQDWLF)ULQJH-Gens mittels 25 LQVLOLFR Analyse
4 Inhaltsverzeichnis Komplettierung von cdna-sequenzen des /XQDWLF)ULQJH-Gens mittels 29 %$&-Bank-6FUHHQLQJ Darstellung der vorhergesagten genomischen Struktur des /XQDWLF)ULQJH- 32 Gens 3.2 Komplettierung der DNA-Sequenzen sowie Darstellung der genomischen 34 Struktur des humanen 5DGLFDO)ULQJH-Gens Komplettierung von DNA-Sequenzen des 5DGLFDO)ULQJH-Gens 35 mittels Amplifikation und Sequenzierung der Introns 4 bis Darstellung der genomischen Struktur des 5DGLFDO)ULQJH-Gens Darstellung der genomischen Struktur des 0DQLF)ULQJH-Gens Suche nach Mutationen innerhalb der drei humanen )ULQJH-Gene (/XQDWLF 40 5DGLFDO0DQLF)ULQJH-Gen) bei 38 Probanden mit $ODJLOOH-Syndrom Sequenzvarianten im /XQDWLF)ULQJH-Gen Sequenzvarianten im 5DGLFDO)ULQJH-Gen Sequenzvariante im 0DQLF)ULQJH-Gen 46 'LVNXVVLRQ 4.1 Komplettierung von DNA-Sequenzen sowie Ermittlung der Exon- Intron- 50 Struktur des /XQDWLF)ULQJH-Gens 4.2 Mutationsanalyse im Bereich des /XQDWLF-, des 5DGLFDO- und des 53 0DQLF-)ULQJH-Gens 4.3 Die )ULQJH-Gene /XQDWLF)ULQJH-Gen DQLF)ULQJH-Gen DGLFDO)ULQJH-Gen Ausblick 62 =XVDPPHQIDVVXQJ /LWHUDWXUYHU]HLFKQLV 7KHVHQ
5 Abkürzungsverzeichnis $EN U]XQJHQ A Adenin Abb. Abbildung ADAM $'LVLQWHJULQ$QG0HWDOORSURWHLQDVH'RPDLQ AGS Alagille-Syndrom APS Ammoniumperoxidsulfat AS Aminosäure abs. absolut BAC %DFWHULDO$UWLILFLDO&KURPRVRPH BLAST %DVLF/RFDO$OLJQPHQW6HDUFK7RRO BLASTN %DVLF/RFDO$OLJQPHQW6HDUFK7RROIRU1XFOHRWLGHV bp Basenpaar C Grad Celsius C Cytosin CADASIL &HUHEUDO$XWRVRPDO'RPLQDQW$UWHULRSDWK\ZLWK6XEFRUWLFDO,QIDUFWVDQG /HXNRHQ]HSKDORSDWK\ C.elegans Caenorhabditis elegans CSL CBF1, 6XSSUHVVRURIKDLUOHVV, LAG1 c Konzentration ca. circa cdna komplementäre Desoxyribonukleinsäure Dll3 murines 'HOWD/LNH 3 Gen DLL3 humanes 'HOWD/LNH 3 Gen DMSO Dimethylsulfoxyd DNA Desoxyribonukleinsäure DSL Delta Serrate Lag2 ES (ZLQJ Sarkom dntps Desoxynukleotidtriphosphat ddntps Didesoxynukleotidtriphosphat E Extinktionswert e Extinktionskoeffizient EDTA Ethylendiaminotetraacetat EGF Epidermaler Wachstumsfaktor EST ([SUHVVHG6HTXHQFH7DJ et al. et alteres
6 Abkürzungsverzeichnis f Verdünnungsfaktor g Gramm G Guanin GlcNac N-Acetyl-Glucose H 2 O Wasser HCl Salzsäure kbp Kilobasenpaare KHCO 3 Kaliumhydrogencarbonat kpa Kilopascall LFNG humanes /XQDWLF)ULQJH-Gen Lfng murines /XQDWLF-)ULQJH-Gen LOH /RVV2I+HWHUR]\JRW\ µ mikro (1x10-6 ) M molar Mb Megabase MFNG humanes 0DQLF)ULQJH-Gen Mfng murines 0DQLF)ULQJH-Gen MIM 0HQGHOLDQ,QKHULWDQFHLQ0DQ MLU Martin-Luther-Universität m Meter mg Milligramm MgCl 2 Magnesiumchlorid min Minute ml Milliliter mrna 0HVVHQJHU-Ribonukleinsäure NaAc Natriumacetat NaCl Kochsalz NaOH Natronlauge NEXT 1RWFK([WUDFHOOXODU7UXQFDWLRQ NICD 1RWFK,QWUDFHOOXODU'RPDLQ NLS 1XFOHDU/RNDOLVD]LRQ6LJQDOV Nr. Nummer OFUT O-Fucosyltransferase ORF 2SHQ5HDGLQJ)UDPH PCR Polymerasekettenreaktion PEST-Sequ. Prolin-, Glutaminsäure-, Serin- und Threoninreiche Sequenz
7 Abkürzungsverzeichnis PIC Polymorphismusinformationsgehalt PNET primitiver neuroektodermaler Tumor RFNG humanes 5DGLFDO)ULQJH-Gen Rfng murines 5DGLFDO)ULQJH-Gen RNA Ribonukleinsäure RNase Ribonuklease s Sekunde s. siehe SDS Natriumdodecylsulfat SNP 6LQJOH1XFOHRWLGH3RO\PRUSKLVP SSCP 6LQJOH6WUDQGHG&RQIRUPDWLRQ3RO\PRUSKLVP T Thymin Tab. Tabelle Taq Thermus aquaticus TACE 7XPRU1HFURVLV)DFWRU$OSKD&RQYHUWLQJ(Q]\PH TBE Tris-Borsäure-EDTA TEMED N,N,N,N -Tetramethylethylendiamin Temp. Temperatur U 8QLW U/min Umdrehung/Minute UV Ultra-Violett V Volt vgl. vergleiche Vol. Volumen
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