Praktikum der Molekulargenetik

Transkript

1 Ulrich Kück (Hrsg.) Praktikum der Molekulargenetik unter der Mitarbeit von A. Bunse, H. Holländer-Czytko, S. Jeske, C. Klämbt, R. Klapper, I. Kubigsteltig, F. Meinhardt, J. Nickelsen, M. Nowrousian, S. Pollmann, S. Pöggeler, T. Strasser, E. Weiler, G. Wolff, K. Wolff Mit 83 Abbildungen und 40 Tabellen. fya Springer

2 Inhalt 1 Modellorgariismen Escherichia coli Historisches Lebenszyklus Technische Entwicklungen Biologische Fragestellungen Genetische Ressourcen Bacillus subtilis Historisches Lebenszyklus Technische Entwicklungen Biologische Fragestellungen Genetische Ressourcen Saccharomyces cerevisiae Historisches Lebenszyklus Technische Entwicklungen Biologische Fragestellungen Genetische Ressourcen Neurospora crassa und Sordaria macrospom Historisches ' Lebenszyklus Technische Entwicklungen ; Biologische Fragestellungen Genetische Ressourcen Chlamydomonas reinhardtii Historisches Lebenszyklus Technische Entwicklungen Biologische Fragestellungen 64

3 XII Inhalt Genetische Ressourcen Arabidopsis thaliana Historisches Lebenszyklus Technische Entwicklungen Biologische Fragestellungen Genetische Ressourcen Drosophila melanogaster Historisches Lebenszyklus Technische Entwicklungen Biologische Fragestellungen Genetische Ressourcen 86 2 Genetische Kreuzungen Escherichia coli Konjugation von E. coli Saccharomyces cerevisiae Zufallssporenanalyse bei S. cerevisiae Neurospora crassa und Sordaridmacrospora Einfaktorkreuzung mit Farbspormutanten Kopplungsanalyse mit transgenen Stämmen Chlamydomorias reinhardtü Tetradenanalyse Arabidopsis thaliana Kreuzung von Arabidopsis.: Kartierung mit CAPS-Markern Drosophila melanogaster Balancer-Chromosomen.., Fliegenzucht Genetische Kreuzungen mit Drosophila DNA-Transformation und Charakterisierung transgener Organismen 141 3!l Escherichia coli und Bacillus subtilis Transformation von E. coli nach der Calciumchlorid- Methode Natürliche Kompetenz von Ä subtilis Transformation von B. subtilis durch Elektroporation

4 Inhalt XIII Isolation von Plasmid-DNA aus Bakterien Isolation von chromosomaler DNA aus Bacillus subtilis Saccharomyces cerevisiae Transformation von 5. cerevisiae mit der Gefriermethode Transformation von 5. cerevisiae durch Elektroporation Isolierung von Gesamt-DNA aus S. cerevisiae zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation Sordaria macrospora Transformation von S. macrospora Isolierung von Gesamt-DNA aus Pilz-Stämmen zum Nachweis einer erfolgreichen Transformation Chlamydomonas reinhardtii Kerntransformation Chloroplastentransformation Isolierung von Gesamt-DNA Arabidopsis thaliana Herstellung stabil transformierter Linien Isolierung von genomischer DNA Transiente Transformation steril angezogener Keimlinge Drosophila melanogaster Nachweis eines markierten P-Elements Genetische Kartierung einer P-Element-Insertion Isolierung genomischer DNA aus Drosophila 219 PCR-Analytik Das Prinzip der PCR Bedeutung der PCR Polymerasen für die PCR PCR-Varianten t NestedVCR, lineare PCR, RAPD-PCR Die RT (reverse Transkription)-PCR Die Real-Time-VCK Experimentalteil PCR-Analyse von transgenen Pilz-Stämmen PCR zum Integrationsnachweis eines Transgens in Arabidopsis thaliana Inverse PCR zur molekularen Kartierung einer P-Element- Insertion bei Drosophila Nachweis eines Transkriptes mittels RT-PCR 241

5 XIV Inhalt 5 RNA-Analytik Transkriptanalysen RNA-Prozessierung bei C. reinhardtii RNA-Isolierung RNA-Gelelektrophorese und Northern Blot Radioaktive Markierung eines Oligonuklssotids und Hybridisierung mit filtergebundener RNA /«-«Vw-Hybridisierungen an Drosophila-Embryonen Analyse von Nukleinsäure-Protein-Interaktionen /«-ivvo-analysen Hefe-HYBRID-Analysen Die Wechselwirkung eines Transkriptionsfaktors mit einem Promotorelement ONE-HYBRID-Analysen durch Selektion von Hefe- Transformanten auf Histidin-Prototrophie ONE-HYBRID-Analysen mit Hilfe von LacZ-Tests ausgewählter Hefe-Transformanten In-vitro-Ana\ysen Nachweis einer Interaktion durch Gelretentionsanalysen Herstellung von Hefe-Proteinextrakt für Bindungsanalysen Herstellung einer radioaktiv markierten Ziel-DNA (bait) Gelretentionsanalyse Heterologe Genexpression Escherichia coli Strategien zur Optimierung der Expression in E. coli Heterologe Synthese eukaryotischer Proteine in E. coli Saccharomyces cerevisiae Strategien zur Optimierung der Expression in 5. cerevisiae Heterologe Genexpression in 5. cerevisiae und Isolierung Virus-ähnlicher Partikel Reportergene Häufig verwendete Reportergene 323 ' ß-Galactosidase ß-Glucuronidase (GUS) Das grün fluoreszierende Protein (GFP) Expression des egfp-gtns in Hyphenpilzen 327

6 Inhalt XV Nachweis der GFP-Fluoreszenz in Sordaria macrospora Nachweis der ß-Glucuronidase-Aktivität in Arabidopsis thaliana Histochemischer GUS-Test Photometrischer GUS-Test X-Gal-Färbungen zur Detektion von Enhancer-trap- Insertionen in Drosophila Nachweis der ß-Galactosidase-Expression im Embryo Nachweis der ß-Galactosidase-Expression in Imaginalscheiben Nachweis der ß-Galactosidase-Expression durch eine Antikörperfärbung Ektopische Expression von Genen in Drosophila melanogaster Experimentalstrategien zur Funktionsanalyse von Drosophila-Genen Überexpression und ektopische Expression eines Transgens Bioinformatik Homologie-Suche in Datenbanken Der BLAST-Algorithmus Die Signifikanz von Alignments Wichtige Parameter für die Datenbanksuche Beispiele zur Datenbanksuche EST- und Gesamtgenom-Datenbanken ESTs (expressedsequence tags) 358 ; Beispiele zu ESTs ' Gesämt-Genom-Sequenzen am Beispiel von Neurospora j crassa 360 j Beispiele zu Arbeiten mit einer Gesamtgenomdatenbank j Beispiele zur Intron-Identifikation mit Hilfe von ESTs und! Gesamtgenomdatenbanken Unbekannte Sequenz - Was tun? 365 ' 9.4 Phylogenie-Analysen 367 i Grundlagen der Stammbaum-Analyse Vorgehen bei der Erstellung eines Stammbaumes Beispiele zur Phylogenie-Analyse 371! 10 Grundtechniken der molekularen Genetik 375 ; 10.1 Phenolisieren von DNA 375

7 XVI Inhalt 10.2 Fällungen von Nukleinsäuren Extraktion von DNA aus Agarosegelen Phenolextraktion aus Agarosegelen Ereeze-and-squeeze-Methode Restriktionsanalyse und Gelelektrophorese Southern Blot ' Markierung von Nukleinsäuren.' Oligo-primed-labelling-Techmk '-Markierung von Oligonukleotiden DNA-DNA-Hybridisierung 386 Referenzen 389 Literatur 389 Internetadressen 396 Hersteller und Bezugsquellen 396 Stammsammlungen 397 Internetportale, Datenbanken und Programme 397 Glossar. 401 Abkürzungen und Symbole 411 Sachverzeichnis 413