1 EINLEITUNG Geschichte und Morphologie der Peroxisomen... 2

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1 I INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG Geschichte und Morphologie der Peroxisomen Metabolismus der Peroxisomen Detoxifikation von ROS und Xenobiotika Peroxisomale ß-Oxidation der Fettsäuren α-oxidation verzweigtkettiger Fettsäuren Etherphospholipid-Biosynthese Peroxisomen-Biogenese Import peroxisomaler Matrixproteine PMP-Import Direkter PMP-Import in Peroxisomen ER-vermittelter PMP-Import Peroxisomale Krankheiten Peroxisomen-Biogenese-Krankheiten (PBDs) Zellweger-Syndrom Zellweger-Syndrom-Tiermodelle Pex19 und Pex19 orthologe Proteine Zielsetzung MATERIAL Allgemeine Materialien Chemikalien Verbrauchsmaterialien Geräte Software Standards und Kits Puffer und Lösungen Enzyme und Puffer Antikörper... 28

2 II Primärantikörper Sekundärantikörper Oligonukleotide PCR Primer qrt-pcr Primer Kultivierung von Fliegen Verwendete Fliegenlinien Fliegenfutter Apfelsaftagarplatten METHODEN Molekularbiologische Methoden DNA-Plasmidisolierung im analytischen Maßstab (Minipräparation) DNA-Plasmidisolierung im mittleren Maßstab (Midipräparation) Transformation chemisch kompetenter E. coli Zellen Natriumacetat-Präzipitation Ligation TOPO-Klonierung Genomische DNA Präparation aus adulten Fliegen Genomische DNA Präparation aus Einzelembryonen Photometrische Nukleinsäure Konzentrationsbestimmung Restriktion von DNA durch Endonukleasen Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von DNA DNA-Gelelektrophorese Aufreinigung von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen DNA-Sequenzierung RNA-Isolierung aus Embryonen, Larven und Puppen cdna-synthese Real-time PCR Analyse (qrt-pcr) Inverse PCR (Plasmid-Rescue) Arbeiten mit Drosophila melanogaster Fliegenhaltung Sammeln von Embryonen, Larven oder Puppen Fixieren von Embryonen Fluoreszenz-Antikörperfärbung an Embryonen Fixierung und Fluoreszenz-Antikörperfärbung an larvalen Geweben Ektopische Expression mittels UAS-Gal4 System... 47

3 III P-Element-Mutagenese Rekombination zur Entfernung einer Mutation Transposase vermittelte P-Element Exzision Komplementationstest Generierung maternaler Nullmutanten Negativer Geotaxis-Versuch Versuch zur Bestimmung der Flugfähigkeit Fütterungsexperimente Histologische Analyse von Drosophila Gehirnen Gaschromatografie / Massenspektrometrie (GC/MS) Elektronenmikroskopie Fixierung, Kontrastierung und DAB-Färbung von Embryonen Trimmen der in Durcupan eingebetteten Embryonen Glasmesserherstellung für Semi- und Ultradünnschnitte Schneiden und Färben von Semidünnschnitten Schneiden und Vorbereiten von Ultradünnschnitten für das TEM ERGEBNISSE Charakterisierung von Genen, die an der Tracheenmorphogenese und - Physiologie beteiligt sind Wurst: Ein neuer Endozytose Regulator der für die tracheale Luftfüllung essentiell ist Clathrin heavy chain (Chc) Expressionsprofil in Drosophila Obstructor-A vermittelt die Integrität der chitinösen EZM Charakterisierung der dpex19 Funktion während der Peroxisomen-Biogenese in Drosophila Charakterisierung der dpex19 mutanten Fliegenlinien Eine Inhibierung der dpex19 Expression verursacht keine Letalität Homozygote dpex19 Defizienz-Mutanten sind embryonal letal dpex19 P-Element-Fliegenlinien zeigen widersprüchliche Letalitätsprofile Die EY21383 Fliegenlinie trägt eine Letalität vermittelnde, dpex19 unabhängige Mutation Die Entfernung der letalen dpex19 unabhängigen Mutation führt zu lebensfähigen EY21383-Fliegen EY21383R Exzision verursacht unterschiedliche dpex19 Deletionen dpex19 F7 ist eine Transkript-Nullmutante... 70

4 IV Maternal-zygotische dpex19 F7m-z- Mutanten sind Transkript- und Protein- Nullmutanten Der Zeitpunkt des dpex19 Genfunktionsverlusts beeinflusst das Letalitätsprofil Die dpex19 F7 vermittelte Letalität kann durch ektopische dpex19 Expression gerettet werden Zellbiologische Analyse der dpex19 Funktion dpex19 kolokalisiert mit dem peroxisomalen Marker GFP.SKL dpex19 und dpex3 kolokalisieren und zeigen eine Lokalisationsabhängigkeit dpex3ha Überexpression verursacht eine dpex19 Mislokalisation dpex19 F7 mutante L3 Larven haben keine GFP.SKL positiven Peroxisomen Maternal zygotische dpex19 F7m-z- Mutanten zeigen eine verringerte Peroxisomenanzahl Phänotypische Untersuchung der dpex19 F7 Nullmutanten Bewegungsdefekte in dpex19 F7 Mutanten Neurodegenerative Defekte in dpex19 F7 mutanten Fliegen dpex19 F7 Mutanten entwickeln melanotische Knoten Physiologische Untersuchungen der dpex19 F7 Mutanten dpex19 F7 Mutanten leiden unter oxidativem Stress In dpex19 F7 Mutanten akkumulieren sehr langkettige Fettsäuren Untersuchung des Nahrungseinflusses auf den dpex19 F7 mutanten Phänotyp Ein Futterzusatz von Kokosnussöl oder Butter rettet die dpex19 F7 vermittelte Letalität Mittelkettige Nahrungs-TAGs retten dpex19 F7 vermittelte Letalität DISKUSSION Analyse der dpex19 mrna und Proteinexpression dpex19 wird ubiquitär, mit zeitlicher und räumlicher Dynamik exprimiert dpex19 ist partiell mit dem ER und Peroxisomen assoziiert Charakterisierung dpex19 mutanter Fliegen Ein dpex19 Genfunktionsverlust vermittelt Letalität dpex19 F7 Mutanten zeigen Bewegungsdefekte, Neurodegeneration und melanotische Knoten dpex19 F7 Mutanten besitzen keine funktionellen Peroxisomen dpex19 F7 mutante Fliegen zeigen einen veränderten Fettsäuremetabolismus dpex19 F7 Mutanten leiden unter oxidativem Stress Genetische und diätische Rettungsexperimente von dpex19 F7 Mutanten Eine ektopische dpex19 Expression rettet dpex19 F7 Mutanten

5 V Eine spezielle Lipiddiät rettet dpex19 F7 mutante Phänotypen dpex19/dpex3 Interaktionsstudien dpex19 und dpex3 zeigen eine partielle Kolokalisation Eine dpex3ha Überexpression führt zu vergrößerten Peroxisomen und einer dpex19 Fehllokalisation dpex3 mislokalisiert in dpex19 F7 Mutanten ZUSAMMENFASSUNG ANHANG dpex19 Transkripte Sequenzierung inverse PCR mit genomischer DNA der EY21383 Linie EY21383 Insertion in genomischer dpex19 Sequenz mit Markierung für RA-CG Primer Anlagerungssequenz im dpex19 Genlocus zur Verifikation des EY21383 P-Elements in dpex EY21383 Jump out Screen Genomische dpex19 Sequenz mit Markierung für RA-CG5325, EY21383 Insertion & Deletion df Genomische dpex19 Sequenz mit Zeichnung für RA-CG5325, EY21383 Insertion & Deletion df8; df10; dd Sequenzvergleich EY Revertanten und white Verfütterung von freien Fettsäuren Fettsäurezusammensetzung der Speisefette und -öle dpex19 Expression während der Ontogenese LITERATURVERZEICHNIS ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS