Strukturelle und funktionelle Analyse des fibronektinbindenden Serumopazitätsfaktors aus Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptokokken)

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Marta Huber
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1 A Strukturelle und funktionelle Analyse des fibronektinbindenden Serumopazitätsfaktors aus Streptococcus pyogenes (Gruppe A Streptokokken) Von der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Technischen Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation von Bernd Kreikemeyer aus Braunschweig

2 Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 A Einleitung 3 1. Einordnung der Streptokokken in das System der Prokaryonten 3 2. Klassifizierung der Streptokokken 3 3. Gruppe A Streptokokken (GAS) Von S. pyogenes verursachte Krankheiten Extrazelluläre Pathogenitätsfaktoren Zellwandassoziierte Pathogenitätsfaktoren Adhärenz als Pathogenitätsmechanismus Sfb Protein, dasfibronektinbindendeadhäsin von S. pyogenes Ziele der hier vorliegenden Promotionsarbeit 18 B Material und Methoden Bakterien Bakterienstämme Stammhaltung Wachstumsmedien Anzucht, Induktion und Herstellung von Lysaten der Bakterien M-Typisierung von S. pyogenes Isolaten Eukaryontische Zellen Zellinien Medien für die Zellkultur Anzucht und Kultivierung der Zellen Plasmide und Bakteriophagen Antibiotikakonzentrationen Oligodesoxynukleotide (Primer) Chemikalien, Enzyme, Kits und andere Biomoleküle Puffer und andere Lösungen Arbeiten mit k Phagen Kultivierung der Phagen / Infektion von E. coli Plaquelift Herstellung von hochtitrigen X Lysaten Extraktion von Phagen DNA Arbeiten mit DNA Restriktionsverdau Ligation Isolierung von Plasmid DNA mit alkalischer Lyse Isolierung von DNA Fragmenten aus Agarosegelen Isolierung chromosomaler DNA aus Streptokokken PCR Amplifikation von DNA DNA-Hybridisierungsexperimente 35

10.1 Markierung der DNA mit Digoxygenin-dUTP 35 10.2 Southern Blotting 36 10.3 Hybridisierung und Entwicklung 36 11. DNA Sequenzierung 37 11.

3 10.1 Markierung der DNA mit Digoxygenin-dUTP Southern Blotting Hybridisierung und Entwicklung DNA Sequenzierung "Taq Cycle" Sequenzierung mit "Dye Deoxy" Terminatoren Aufreinigung der Sequenzierproben Auswertung der Daten Elektrophoretische Methoden Agarosegelelektrophorese Elektrophorese in diskontinuierlichen SDS-Polyacrylamid-Gelen Western-Blot Nachweismethoden für Bindungsproteine Immunologischer Nachweis membrangebundener Proteine Radioautographischer Nachweis von Protein-Protein Wechselwirkungen Schnelltest auf Expression rekombinanter Proteine in E. coli Nachweis im Kolonielift/Plaquelift "Enzyme linked immunosorbent assay" (ELISA) Transformationen und kompetente Zellen Herstellung kompetenter E. coli Zellen für die Transformation Herstellung kompetenter coli Zellen für die Elektroporation Herstellung kompetenter S. pyogenes Zellen für die Elektroporation Transformation von E. coli mit Plasmid-DNA Elektroporation Proteinchemische Methoden Bestimmung der Proteinkonzentration Bindungsversuche mit radioaktiv markierten Proteinen Radioaktive Markierung von Proteinen Bestimmung der spezifischen Ativität Bindungsversuch für I25 I markierte Proteine Kompetitive Hemmversuche Proteinumpufferung durch Dialyse Chromatographische Methoden Reinigung von Fibronektin aus Humanplasma Aufreinigung von Glutathion-S-Transferase Fusionsproteinen Native Aufreinigung von His-Tag Fusionsproteinen Adhärenzversuche Adhärenzversuche mit gekoppelten Latexpartikeln Kopplung von 3 um Latexpartikeln Überprüfung der Kopplungseffizienz Adhärenzversuch Adhärenzversuche mit S. pyogenes A Test auf Serumopazitätsfaktoraktivität Der Mikrotiterplatten-Test SDS-PAGE "Overlay"-Test "Serum agar slide inhibition" -Test Herstellung von polyklonalen Seren 50

4 III C Ergebnisse Charakterisierung der XA45 und XA75 Klone Bestimmung der Spezifität der Fibronektinbindung Bestimmung der moi Strukturelle Untersuchung der Fibronektinbindungskomponente aus S. pyogenes A Subklonierung des Inserts aus dem Phagenklon A.A75 SA Kartierung der Restriktionsschnittstellen Herstellung von Deletionsderivaten und Untersuchung ihrer Bindungseigenschaften Differenzierung des sßll Gens vom sfl>\ Gen durch DNA-Hybridisierungen Southern Blot mit der sßl Gensonde Southern Blot mit der sßll Gensonde Bestimmung der Nukleotidsequenz des sfbll Gens Aminosäuresequenz und Homologien zu anderen Proteinen Die repetitive Sfbll Domäne und ihre Homologien zu anderen Fibronektinbindungsproteinen Funktionelle Untersuchung des Sfbll Proteins Lokalisation der Fibronektinbindungsdomäne auf dem Sfbll Protein Amplifikation und Expression rekombinanter sßll Bereiche Nachweis der Oberflächenlokalisation und Funktionalität des Sfbll Proteins beim S. pyogenes Stamm A Inhibition der Fibronektinbindung an S. pyogenes durch gereinigtes Sfbll Fusionsprotein Inhibition der Fibronektinbindung an S. pyogenes durch polyklonales Anti-Sfbll Antiserum Lokalisation der Sfbll Bindungsdomäne auf dem Fibronektinmolekül Untersuchungen zur möglichen Funktion des Sfbll Proteins als Adhäsin Adhärenz proteingekoppelter Latexpartikel an verschiedene Zellinien Identifizierung der Adhärenz-vermittelnden Sfbll Proteindomäne Adhärenz des S. pyogenes Stammes A75 an HEp2 Epithelzellen Konstruktion einer sßll negativen Insertionsmutante Überprüfung des Insertionsereignisses durch gezielte PCR und Southern Blots Die Mutante A75SfbII" hat einen Serumopazitätsfaktor (SOF) negativen Phänotyp Charakterisierung der SOF Aktivität Identifizierung der für die SOF Aktivität verantwortlichen Sfbll Proteindomäne Die SOF Aktivität ist M-Typ spezifisch 91

5 IV Inhaltsverzeichnis 4. Epidemiologische Untersuchungen Untersuchungen zur Präsenz des sßll Gens in S. pyogenes Isolatgruppen Das sßll Gen zeigt Variabilität in dem für den N-Terminus kodierenden Genabschnitt Amplifizierung und partielle Sequenzierung von sßll Genen aus einem M2 und M13 Stamm Sequenzvergleich aller bisher analysierten Sfbll Proteine Test von Humanseren auf Präsenz von Anti-Sfbll Antikörpern Reaktivität von Humanseren gegen verschiedene Sfbll Proteinepitope im Western Blot 100 D Diskussion 103 E Literaturverzeichnis 120 F Anhang Abkürzungsverzeichnis Lebenslauf Danksagung

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