1 Einleitung Material und Methoden

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Gerd Kramer
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1 1 Einleitung P-Typ ATPasen Struktur und Funktion von P-Typ ATPasen CPx-ATPasen Nukleotidbindungs-/Phosphorylierungsdomäne Aktuatordomäne Cytoplasmatische Schwermetallbindungsdomänen Transmembrandomäne Genomische Organisation von CPx-ATPasen Sulfolobus solfataricus und seine beiden CPx-ATPasen Ziel der Arbeit 22 2 Material und Methoden Material Escherichia coli Medien und Antibiotika Sulfolobus solfataricus Medien Plasmide Stämme Antikörper und Antisera Oligonukleotide Mikrobiologische Methoden Fermentation von Escherichia coli Erstellung elektrokompetenter E.coli Zellen Transformation von E.coli durch Elektroporation Fermentation von Sulfolobus solfataricus Molekularbiologische Methoden Präparation von DNA Präparation genomischer DNA Ethanolfällung mit Natriumchlorid Plasmid-Minipräparation Plasmid-Maxipräparation Gelelution von DNA Klonierung 34

2 Polymerase-Kettenreaktion Restriktion Ligation Proteinexpression und Membranpräparation Heterologe Expression in E.coli Präparation von E.coli-Membranen Proteinbiochemische Methoden Proteinaufreinigung Solubilisierung Streptactin-Affinitätschromatographie Gelfiltrationschromatographie Rekonstitution der ATPase in Lipide Herstellung des ATPase-Inhibitors ortho-vanadat ATPase-Aktivitätstest Bestimmung der thermodynamischen Parameter der ATPase-Aktivität Kupferbindungsassay Bestimmung der Nukleotidbindung über Gelfiltration Proteinanalytische Methoden Proteinkonzentrationsbestimmung mit BCA Proteinfällung mit TCA Thiolgruppenbestimmung mit DTNB Bestimmung der Detergenzkonzentration SDS-PAGE Westernblot-Nachweis von Proteinen Biophysikalische Methoden Fluoreszenzspektroskopie Aufbau eines Fluoreszenzspektrometers Gleichgewichtsbindung von mant-nukleotiden Gleichgewichtsbindung von Nukleotiden in Gegenwart von mant-atp Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (FTIR) 54

3 Aufbau eines FTIR-Spektrometers Standardküvette Sekundärstrukturanalyse mittels FTIR-Spektroskopie FTIR-Differenzspektroskopie 64 3 Ergebnisse In vivo Charakterisierung der beiden CPx-ATPasen aus Sulfolobus solfataricus In vivo Charakterisierung der CPx-ATPase CopA aus Sulfolobus solfataricus In vivo Charakterisierung der CPx-ATPase CopB aus Sulfolobus solfataricus Kupfertoleranz in Sulfolobus solfataricus Wildtyp und ΔcopB CopB Klonierung des copb-gens Heterologe Expression des CopB in E.coli Optimierung der Expressionsparameter Reinigung der rekombinanten ATPase CopB Analyse der gereinigten ATPase CopB Gelfiltration Detergenztest Thiolgruppenbestimmung mit DTNB Sekundärstrukturanalyse Nachweis der spezifischen Hydrolyseaktivität Grundaktivität Inhibition der ATPase-Aktivität durch ortho-vanadat Proteinbiochemische Charakterisierung Temperaturabhängigkeit der Hydrolyseaktivität von CopB Lipidabhängigkeit der Hydrolyseaktivität von CopB Stimulation der ATPase-Aktivität durch Metallionen 90

4 Thermodynamische Untersuchung der ATPase- Aktivität Bestimmung der transmembranen Metallbindungsstellen Klonierung der copb-gen-mutanten Reinigung der verschiedenen CopB-Mutanten Stimulation der ATPase-Aktivität durch Metallionen Anzahl der transmembranen Metallbindungsstellen FTIR-spektroskopische Untersuchungen an CopB CopB-B Analyse der gereinigten katalytischen Domäne CopB-B Nachweis der spezifischen Hydrolyseaktivität Grundaktivität Inhibition der ATPase-Aktivität durch ortho-vanadat Stimulation der ATPase-Aktivität durch Metallionen Proteinbiochemische Charakterisierung Temperaturabhängigkeit der Hydrolyseaktivität von CopB-B Michaelis-Menten Kinetik Hydrolyseaktivität in Abhängigkeit der Proteinkonzentration Thermodynamische Untersuchung der ATPase- Aktivität Bindung von mant-atp/adp an CopB-B Bindung verschiedener Nukleotide an CopB-B Messung der ATPase-Aktivität des CopB-B mittels FTIR- Spektroskopie Photolytische Freisetzung von ATP Zuordnung der Phosphatbanden im Photolysespektrum Hydrolyse von ATP durch CopB-B Zuordnung der Phosphatbanden in den Spektren der Hydrolysereaktion 120

5 Kinetische Modellierung der ATPase-Reaktion des CopB-B Diskussion In vivo Charakterisierung der CPx-ATPasen aus Sulfolobus solfataricus In vivo Charakterisierung der CPx-ATPase CopA aus Sulfolobus solfataricus In vivo Charakterisierung der CPx-ATPase CopB aus Sulfolobus solfataricus CopB Konstruktion des Expressionsplasmids Optimierung der Expressionsparameter ATPase-Aktivität Grundaktivität Metallionen-stimulierte Aktivität Thermodynamik der Hydrolysereaktion Lokalisation und Funktion der Metallbindungsstellen der ATPase CopB HMA Domäne Transmembrane Metallbindungsstellen CopB-B CopB-B als Modell für die ATPase CopB Nukleotidbindung an CopB-B Nukleotidbindung an CopB-B in der FTIR-Spektroskopie ATP-Hydrolyse als Mehrstufenprozess Kinetische Untersuchung der ATP-Hydrolyse Modell der CopB-B katalysierten ATP-Hydrolyse Zusammenfassung Summary Anhang Literaturverzeichnis Bereits veröffentlichte Arbeiten 164

6 7.3 Abkürzungsverzeichnis Lebenslauf Danksagung Erklärung 168

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