Einzeldomänen-Antikörpern durch mikrobielle Oberflächenpräsentation molekularer Bibliotheken

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1 Isolierung und Charakterisierung von Einzeldomänen-Antikörpern durch mikrobielle Oberflächenpräsentation molekularer Bibliotheken Vom Fachbereich Chemie der Technischen Universität Darmstadt TECHNISCHE UNIVERSITÄT DARMSTADT Clemens-Schöpf-Institut für Organische Chemie und Biochemie zur Erlangung des akademischen Grades eines Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.) genehmigte Dissertation vorgelegt von Dipl. Biol. Björn Steinmann aus Weinheim Referent: Korreferent: Tag der Einreichung: Tag der mündlichen Prüfung: Prof. Dr. Harald Kolmar Prof. Dr. Siegfried Neumann 03. November Dezember 2014 Darmstadt, 2015 D17

2 Inhaltsverzeichnis Publikationen, die im Rahmen dieser Doktorarbeit veröffentlicht wurden Tagungsbeiträge Zusammenfassung Danksagung I I III VII 1 Einleitung Immunsystem Humane Antikörper-Isotypen Immunglobulin G (IgG) und davon abgeleitete Bindedomänen Schwerkettenantikörper (HCAb) VN AR - variable Domäne des new antigen receptor VHH-Antikörper (variable domain of the heavy-chain of a heavy-chain antibody) VHH-Antikörper als Biopharmazeutika Durchmusterung von Varianten-Bibliotheken im Hochdurchsatz Phagen-Oberflächenpräsentation {phage display) Hefe-Oberflächenpräsentation (yeast display) Verwendete Antigene Zielsetzung 22 2 Materialien Bakterien-und Hefestämme Neuweltkamelide DNA-Längenstandards und Protein-Molekulargewichtsmarker DNA-Längenstandards für die DNA-Elektrophorese Lambda DNA/ co47i (Avall) Marker, 13 (MBI Fermentas GmbH, St. Leon- Rot / Thermo Fisher Scientific, Geel, Beglien) Log DNA Ladder ( kb) (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) bp DNA Ladder (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) 'GeneRuler DNA Ladder, Ultra Low Range, ready-to-use (MBI Fermentas GmbH, St. Leon-Rot / Thermo Fisher Scientific, Geel, Beglien) Molekulargewichtsmarker für die Proteinelektrophorese 28 IX

3 Unstained Protein Molecular Weight Marker (MBI-Fermentas) PageRuler Prestained Protein Ladder (MBI-Fermentas) Prestained Protein Marker, Broad Range (7-175 kda) (New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main) Oligodesoxyribonukleotide Plasmide pakds200dsba-mt pct-vhh pexpelb-vhh ptet pelb-vhh-ap pydapp8-vhh-hufc Enzyme, Proteine und Nukleinsäuren Chemikalien Sonstige Materialien und Geräte Nährmedien Zur Verwendung mit Escherichia coli Zur Verwendung mit Saccharomyces cerevisiae Lösungen und Puffer Kits Software zur Datenverarbeitung 57 3 Methoden Handhabung von Bakterien Lagerung von Escherichia coli Vermehrung und Kultivierung von Escherichia coli Bestimmung der Zelldichte Transformation von Escherichia coli mittels Elektroporation Produktion von Proteinen in Escherichia coli Periplasmapräparation von Proteinen aus Escherichia coli Handhabung von Hefen Lagerung und Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae Induktion der Oberflächenpräsentation nach Wittrup et al 61 X

4 3.3 Molekularbiologische Arbeitsmethoden Vorbereitung von verwendeten Geräten und Lösungen Reinigung von DNA mittels Phenol/Chloroform-Extraktion Präzipitation von DNA mittels Ethanol und Ammoniumacetat Trennung und Reinigung von DNA-Fragmenten durch Sucrosedichtegradientenzen-trifugation Agarosegelelektrophorese Extraktion von DNA aus Agarosegelen und PCR-Ansätzen mittels des Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System Kits (Promega) Isolierung von Plasmid-DNA aus Escherichia coli Isolierung von Plasmid-DNA in analytischen Mengen (Mini-Präparation) mit Hilfe des Wizard Plus SVMinipreps DNA Purification System (Promega) Isolierung von Plasmid-DNA in semi-präparativen Mengen (Midi- Präparation) mit Hilfe des Wizard Plus SV Midipreps DNA Purification System (Promega) Isolierung von Plasmid-DNA in präparativen Mengen mittels CsCl-Gradient Isolierung von Plasmid-DNA aus Saccharomyces cerevisiae Konzentrationsbestimmung von DNA in wässrigen Lösungen Hochdurchsatz Amplicon Sequenzierung (454 Sequencing) Enzymatische Manipulation von DNA Spaltung von DNA mittels Restriktionsendonukleasen Ligation von DNA-Fragmenten Polymerasekettenreaktion (PCR) Kolonie PCR mit Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae Splicing by overlap extension PCR (SOE-PCR) Proteinchemische Arbeitsmethoden Konzentrationsbestimmung von Proteinen in wässrigen Lösungen Denaturierende Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Herstellung von 12,5 % (v/v) Polyacrylamidgelen Durchführung der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) Entwicklung eines SDS-Polyacrylamidgels Immunchemischer Nachweis mittels Western Blot 73 XI

5 3.5.3 Zellaufschluss von Escherichia coli Zellaufschluss mittels French Pressure Cell Press Zellaufschluss mittels Cell Disruptor Immobilized Metal Chelate Ajfinity Chromatography (IMAC) Fast Protein Liquid Chromatography - FPLC Dialyse von Proteinen Biotinylierung von Proteinen Immunchemische Analysen unter Verwendung des TECAN GENios ELISA readers Bio-Layer Interferometry (fortebio ) Methoden zur Gewinnung und Manipulation von RNA aus dem Vollblut von Lama glama Immunisierungsstrategie für Lama glama Blutentnahme bei Lama glama Isolierung von Lymphozyten mittels Ficoll-Gradienten-Zentrifugation Zellzahlbestimmung mit einem CASY -Analysegerät RNA-Extraktion aus dem Vollblut von Lama glama cdna-synthese durch Reverse Transkription Methoden zur Generierung von VHH-Bibliotheken Transformation von Escherichia coli ER2738 zur Generierung von phagemid Bibliotheken Transformation von Saccharomyces cerevisiae mittels Elektroporation Durchflusszytometrische Arbeitsmethoden Immunfluoreszenz-Markierung von Saccharomyces cerevisiae (EBY100) Durchflusszytometrie mit Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung eines MoFlo-Sortiergerätes Durchflusszytometrie mit Saccharomyces cerevisiae unter Verwendung eines INFLUX Sortiergerätes Analytische Durchflusszytometrie mit Saccharomyces cerevisiae am Accuri C6 Flow Cytometer Magnetische Sortierung (MACS) zur Abreicherung von unerwünschten Zellpopulationen 86 XII

6 4 Ergebnisse und Diskussion Erstellung und Durchmusterung einer naiven VHH-Bibliothek aus Lama glama Konzept zur Gewinnung des naiven VHH-Repertoires Probenentnahme und Generierung der cdna Erstellung einer naiven VHH-Bibliothek im Phagen-Format Amplifikation und Modifikation der VHH-DNA mittels Polymerase-Ketten- Reaktion Vorbereitung von VHH-DNA und Vektor sowie anschließende Klonierung Generierung der VHH-Bibliothek durch Transformation von Escherichia coli ER Validierung der VHH-Bibliothek im Phagen-Format Diskussion Erstellung einer naiven VHH-Bibliothek im Hefe-Format Amplifikation und Modifikation der VHH-DNA sowie des Vektors pct Transformation von Saccharomyces cerevisiae EBY100 zur Erstellung einer naiven VHH-Bibliothek durch homologe Rekombination Validierung der naiven Hefe-Bibliothek Validierung durch Einzelklon-Sequenzierung Validierung mittels Hochdurchsatz-Sequenzierung Mikroskopische und Durchflusszytometrische Analyse Diskussion FACS gestützte Durchmusterung der Hefe-Bibliothek Durchmusterung der VHH-Bibliothek nach Bindern gegen humanes C4b Protein Durchflusszytometrische Analyse von Einzelklonen der Durchmusterung gegen hc4bp Diskussion Durchmusterung der VHH-Bibliothek nach Bindern gegen Saglin aus Anopheles spec Vertiefung der Analyse der Saglin-Einzelklone 3 und Titration auf Hefezellen zur Bestimmung der Bindeeigenschaften des Saglin- Einzelklons XIII

7 Diskussion Durchmusterung der naiven VHH-Bibliothek nach Bindern gegen humanes P-Cadherin Vertiefung der Analyse von Einzelklon 2 und Diskussion der Ergebnisse Zusammenfassung Erstellung und Durchmusterung einer durch Immunisierung affinitätsgereiften VHH- Bibliothek aus Lama glama Erstellung einer affinitätsgereiften VHH-Antikörper-Bibliothek in Hefen Immunchemische Analyse des Prä- und Postserums Amplifikation und Modifikation der VHH-DNA sowie des Vektors pct Transformation von Saccharomyces cerevisiae EBY100 durch homologe Rekombination zur Erstellung einer durch Immunisierung affinitätsgereiften VHH-Bibliothek Validierung der affinitätsgereiften VHH-Hefebibliothek Diskussion Durchmusterung der affinitätsgereiften VHH-Hefe-Bibliothek mittels FACS Isolierung von VHH-Einzelklonen gegen huegfr Analyse der huegfr bindenden Einzelklone Zusätzliche Sortierungen nach huegfr bindenden Hefezellen Analyse von Einzelklonen der zweiten Durchmusterung nach huegfr bindenden Hefezellen Diskussion der Ergebnisse Isolierung von VHH-Einzelklonen gegen EphA Diskussion der Ergebnisse Isolierung von VHH-Einzelklonen gegen megfr Diskussion der Ergebnisse Zusammenfassung der löslichen Expression von VHH-Antikörpern in Escherichia coli und Saccharomyces cerevisiae Verwendung des Vektorkonstrukts pex in Escherichia coli Verwendung der Vektorkonstrukte pmx und ptet in Escherichia coli Verwendung des Vektorkonstrukts pyd in Saccharomyces cerevisiae 174 XIV

8 Diskussion der Ergebnisse Zusammenfassung und Ausblick Literaturverzeichnis 181 Lebenslauf XXI XV