Gewebeprotektive Eigenschaften von. lnterleukin-22 in der Leber
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- Berthold Baumgartner
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1 Gewebeprotektive Eigenschaften von lnterleukin-22 in der Leber Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften vorgelegt beim Fachbereich Biochemie, Chemie und Pharmazie der Johann Wolfgang Goethe-Universität in Frankfurt am Main von Patrick Scheiermann aus Essen Frankfurt 2014 (D 30)
2 Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 8 2 Einleitung lnterleukin lnterleukin-22 ist ein Mitglied der lnterleukin-10 Familie und wird von leukozytären Zellen gebildet Die Familien der Signal Transducer and Activator of Transcription und der Suppressor of Cytokine Signaling Proteine lnterleukin-22 wirkt über eine Veränderung der Genexpression und ist ein induzierbares Zytokin Bei akuter Schädigung epithelialer Organe zeigt lnterleukin-22 protektive Eigenschaften Potenzial und Risiken einer Therapie mit rekombinantem lnterleukin Paracetamol und Leberschaden Paracetamol Intoxikation als Problem der westlichen Welt Metabolisierung von Paracetamol Damage-associated molecular pattems in steriler und systemischer Entzündung Sterile Entzündung Systemische Entzündung durch Endotoxinämie oder Sepsis lnterleukin lnterleukin-36 ist ein Mitglied der IL-1 Familie lnterleukin-36a/ß/y sind proinflammatorische Zytokine Ziele der vorliegenden Arbeit 25 3 Material & Methoden Allgemeine Chemikalien und Reagenzien Tiermodelle 26
3 3.2.1 Bestimmung der biologischen Aktivität des rekombinanten murinen lnterleukin Paracetamol-induzierte akute Leberschädigung Systemische Entzündung durch Injektion von Lipopolysaccharid Induktion einer Sepsis durch zökale Ligatur und Punktion Serumaufarbeitung und Bestimmung der Transaminasenaktivität Zellkultur Zelllinien und Medium Stimulation der Zelllinien Einfrieren und Auftauen von Zelllinien Isolation muriner Hepatozyten Molekularbiologische und proteinbiochemische Techniken Enzyme-Linked Immuno SorbentAssay Isolation von RNA aus Lebergewebe und aus Zellkulturmaterial Bestimmung des RNA Gehaltes von Gewebe und Zellkulturmaterial RNA Gelelektrophorese Affymetrix GeneChip Herstellung von komplementärer DNA TaqMan-Polymerase Kettenreaktion Standard"-Polymerase Kettenreaktion aus Zellkultur Gelelektrophorese von Produkten einer Polymerase Kettenreaktion Isolation von Proteinen aus Lebergewebe Bestimmung des Proteingehaltes in Lebergewebe und Hepatozyten Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese Semi-Dry Western Blot und Proteindetektion mit Antikörpern Quantifizierung des reduzierten Glutathions in der Leber Histologie und Immunhistochemie aus Lebergewebe 53
4 3.5.1 Anfertigen von Gewebeschnitten Hämatoxylin & Eosin-Färbung von murinem Lebergewebe Immunhistochemie in murinem und humanem Lebergewebe Puffer, Gele und Wachstumsfaktoren Puffer Gele Statistik und computerbasierte Datenauswertung 62 4 Ergebnisse Bioaktives IL-22 aktiviert STAT3 in der murinen Leber IL-22 reduziert den Paracetamol-induzierten Leberschaden in der Maus IL-22 aktiviert in der Leber prototypische STAT3-abhängige Gene IL-22 hat keinen Einfluss auf die Zytochrom P450 Enzyme Cyp1a2, Cyp2e1 und Cyp3a IL-22 hat keinen Einfluss auf den hepatischen Gehalt an reduziertem Glutathion IL-22 hat keinen Einfluss auf die Bildung von Paracetamol Adduklen IL-22 induziert eine differenzierte Genexpression in der Leber Auswertung des murinen GeneChips STEAP4 und Bcl3 sind ll-22-abhängige Gene in der Maus STEAP4 und Bcl3 sind IL-22-induzierbare Gene in humanen Zellen Untersuchungen zu rekombinantem Serumamyloid A, a1-antichymotrypsin und a1-antitrypsin bei Paracetamol-induziertem Leberschaden Rekombinantes humanes Serumamyloid beeinflusst den Paracetamolinduzierten Leberschaden nicht Rekombinantes murines a1-antichymotrypsin und rekombinantes humanes a1-antitrypsin beeinflussen den Paracetamol-induzierten Leberschaden nicht 74
5 4.9 IL-22 induziert die Proliferation von Hepatozyten bei Paracetamol-induzierter Leberschädigung Therapeutische Gabe von IL-22 bei letaler Paracetamol Dosis L-22 in Kombination mit N-Acetylcystein bei letaler Paracetamol Dosis Etablierung einer suboptimalen Dosierung von N-Acetylcystein IL-22 verstärkt die protektive Wirkung von N-Acetylcystein bei Paracetamol-induziertem Leberschaden IL-22 induziert die Proliferation von Leberzellen bei N-Acetylcysteinbehandelter letaler Paracetamol Dosis IL-22 hemmt die Genexpression von TNFa und reduziert die TNFa Serumkonzentration während Paracetamoi-induzierten Leberschadens IL-22 hemmt die hepatische Genexpression von IL-36y bei Paracetamolinduziertem Leberschaden Der ll-36-rezeptor IL-1Rrp2 ist in der Leber exprimiert Expression von IL-1Rrp2 in der murinen Leber Expression von IL-1Rrp2 in humanen Huh7 Leberzellen Expression von IL-1Rrp2 in der humanen Leber Wirkung von IL-36y in humanen Huh7 Leberzellen IL-36y induziert Ccl20 in Huh7 Leberzellen IL-36-Rezeptorantagonist neutralisiert die IL-36y-induzierte Expression von Ccl20 in Huh7 Zellen Die Ccl20 Genexpression ist bei Paracetamol-induzierter Leberschädigung in der Maus erhöht IL-36y in der Leber bei systemischer Entzündung In Leberzellen lässt sich IL-36y durch proinflammatorische Zytokine induzieren Bei systemischer Entzündung ist IL-36y in der murinen Leber induziert Ccl20 ist in der Leber bei systemischer Entzündung in der Maus induziert.. 94
6 4.19 Die Verabreichung von IL-22 an Mäuse zeigt keine akuten proinflammatorischen oder immunsuppressiven Effekte 95 5 Diskussion IL-22 und Paracetamol-induzierter Leberschaden Paracetamol-induzierter Leberschaden und IL-36y Schlussfolgerung und Ausblick Literatur Anhang Spezifische Nukleotidsonden und Primer Spezifische murine Nukleotidsonden Spezifische humane Nukleotidsonden und Primer Versuchs- und Überwachungsprotokolle für Versuchstiere Versuchsprotokoll für Versuche zu muriner APAP Intoxikation Versuchsprotokoll für Versuche zu muriner Endotoxinämie Versuchsprotokoll für Versuche zu muriner Sepsis Oberwachungsprotokoll für Tierversuche Abkürzungen Abbildungs- und Tabellenverzeichnis Veröffentlichungen und Kongressbeiträge Veröffentlichungen Kongressbeiträge Danksagung Lebenslauf 147
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