Inaugural-Dissertation. zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. des Fachbereichs Biologie und Geografie an der Universität Duisburg-Essen
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- Günther Hartmann
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1 Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden gegen proinflammatorische Zytokine bei der experimentellen Herpes Simplex Virus Typ 1 Keratitis und deren Einfluss auf die Immunreaktion Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. des Fachbereichs Biologie und Geografie an der Universität Duisburg-Essen vorgelegt von Susanne Wasmuth aus Essen Dezember Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Helmut Esche 2. Gutachter: Prof. Dr. med. Arnd Heiligenhaus 3. Gutachter: Prof. Dr. rer. nat. Bertram Opalka Vorsitzender des Prüfungsausschusses: Prof. Dr. Gerhard Henkel Tag der mündlichen Prüfung: 13. April 2005
2 Die der vorliegenden Arbeit zugrundeliegenden Experimente wurden im Histologischen Labor der Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde, dem zentralen Tierlabor und dem Institut für Virologie des Universitätsklinikums in Essen sowie im Ophtha-Lab der Augenärzte am St. Franziskus Hospital in Münster durchgeführt.
3 Berichte aus der Biologie Susanne Wasmuth Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden gegen proinflammatorische Zytokine bei der experimentellen Herpes Simplex Virus Typ 1 Keratitis und deren Einfluss auf die Immunreaktion Shaker Verlag Aachen 2006
4 Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Zugl.: Duisburg-Essen, Univ., Diss., 2005 Copyright Shaker Verlag 2006 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN ISSN Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet: info@shaker.de
5 FÜR MEINE ELTERN
6
7 VII Inhaltsverzeichnis INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung Herpesviren Erkrankungen durch Herpesviren Herpetische stromale Keratitis allgemein Zytokine allgemein Das Zielzytokin Tumor-Nekrose-Faktor-α Das Zielzytokin Interleukin Das Zielzytokin Interferon-γ Matrix Metalloproteinasen Antisense-Oligonukleotide Zielsetzung der Arbeit Material und Methoden Material Chemikalien Verbrauchsmaterial Geräte Sonstiges Medien für Zellkultur RPMI RPMI-Agarose Medium für Vero- und L929 Zellen Lymphozytenmedium Medium für CTLL-2 Zellen Einfriermedium Verwendete Zelllinien Vero CTLL L Puffer und Lösungen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) Erythrozyten-Lysepuffer 23
8 Inhaltsverzeichnis VIII HEPES-Mercaptoethanol Tris-EDTA (TE)-Puffer Gepuffertes Formalin zur Fixierung Thiazolylblau Tetrazoliumbromid (MTT)-Lösung Material für Durchflusszytometrie Puffer für Durchflusszytometrie Antikörper für Durchflusszytometrie Abstopplösung für IL-2 Bioassay Actinomycin D-Lösung Kristallviolettlösung Trypanblaulösung Enzephalomyokarditis (EMC)-Virussuspension Lösungen für enzygekoppelten Immunadsorptionstest (ELISA) Beschichtungspuffer ph 9, Beschichtungspuffer ph 6, Waschpuffer Verdünnungslösung Substratpuffer Stopplösung OptEIA TM Kits für ELISA Lösungen für Zymographie Probenpuffer Laufpuffer für Elektrophorese Reaktionspuffer Coomassielösung Entfärbelösung Lösungen für Westernblot Tris gepufferte Kochsalzlösung mit Tween (TTBS) Blockpuffer Antikörper 27
9 IX Inhaltsverzeichnis DNS-Oligonukleotide Versuchstiere Anzahl der eingesetzten Versuchstiere Methoden Zellen Kultur Einfrieren Auftauen Trypanblaufärbung Histologie Aminopropyltriethoxysilane (APES)-Beschichtung Poly-L-Lysin- (PLL)-Beschichtung Paraffineinbettung fixierter Präparate Hematoxylin-Eosin-Färbung Hoechstfärbung Virusstamm Virusvermehrung Inaktivierung des Virus Plaqueassay In vitro Studien zur Wirkung der Oligonukleotide In vitro Studien zur Aufnahme von ASON in Zellen Fluoreszenzmikroskopie Durchflusszytometrie Behandlung der Versuchstiere Haltung der Versuchstiere Narkose der Versuchstiere Tötung der Versuchstiere HSV-Infektion Klinische Bewertung Proliferationstest mit 3 H-Thymidin Bestimmung des neutralisierenden Antikörpertiters gegen HSV-1 37
10 Inhaltsverzeichnis X Messung der Hautreaktion vom verzögerten Typ (DTH, delayed type hypersensitivity reaction) Herstellung der Sucralfat-Pellets für den Mikropocketassay Applikation der Oligonukleotide in vivo Kornealer Mikropocketassay Subkonjunktivale Injektion Subepitheliale korneale Injektion Aufarbeitung von ganzen Augen Aufarbeitung von Hornhäuten für die Bestimmung des Zytokingehalts für die Zymographie und den Western Blot Bestimmung des Proteingehalts Zytokinquantifizierungen mit ELISA Bestimmung von bioaktiven Zytokinen mit Bioassays Bestimmung des TNF-α-Gehalts mit Bioassay Bestimmung des IL-2-Gehalts mit Bioassay Bestimmung des IFN-γ-Gehalts mit Bioassay Zymographie Western Blot Studiendesign Statistik Ergebnisse Antisensefreisetzung aus Sucralfat-Pellets Einfluss der Oligonukleotide auf Zellvitalität und Proliferation In vitro Inkubation mit ASON und KON gegen TNF-α mrna In vitro Inkubation mit ASON und KON gegen IL-2 mrna In vitro Inkubation mit ASON und KON gegen IFN-γ mrna Aufnahme der ASON in Zellen aus den regionalen Lymphknoten und der Milz Einfluss der Stimulation auf die Aufnahme der ASON in Zellen Applikation der Oligonukleotide in vivo Sucralfat-Pellets 58
11 XI Inhaltsverzeichnis Subkonjunktivale Injektion Subepitheliale Injektion Lokale Effekte nach subepithelialer Gabe von ASON gegen TNF-α mrna Klinischer Verlauf Histologie Ulzerationsrate Inflammatorische Zellen in der Kornea Virusreplikation im Auge Zytokingehalt in der Hornhaut Caseinolytische und gelatinolytische Aktivitäten von Extrakten der Hornhaut Systemische Effekte nach subepithelialer Gabe von ASON gegen TNF-α mrna Neutralisierender Serumantikörper Hautreaktion vom verzögerten Typ Proliferationsassay Lokale Effekte nach subepithelialer Gabe von ASON gegen IL-2 mrna Klinischer Verlauf Inflammatorische Zellen in der Hornhaut Zytokingehalt in der Hornhaut Systemische Effekte nach subepithelialer Gabe von ASON gegen IL-2 mrna Hautreaktion vom verzögerten Typ Proliferationsassay Zytokinsezernierung nach IL-2-ASON-Behandlung Lokale Effekte nach subepithelialer Gabe von ASON gegen IFN-γ mrna Klinischer Verlauf Inflammatorische Zellen in der Hornhaut Zytokingehalt in der Hornhaut Systemische Effekte nach subepithelialer Gabe
12 Inhaltsverzeichnis XII von ASON gegen IFN-γ mrna Hautreaktion vom verzögerten Typ Proliferationsassay Zytokinsezernierung nach IFN-γ-ASON-Behandlung Diskussion ASON allgemein In vitro Aufnahme von ASON in Zellen aus Milz und Lymphknoten Wirksamkeit von ASON in vitro Wirksamkeit von ASON gegen TNF-α mrna Wirksamkeit von ASON gegen IL-2 mrna Wirksamkeit von ASON gegen IFN-γ mrna In vivo Aufnahme von ASON in der Hornhaut Mikropocketassay Subkonjunktivale Injektion Subepitheliale Injektion In vivo Daten allgemein Blepharitis Epitheliale Keratitis Nach Behandlung mit ASON gegen TNF-α mrna Nach Behandlung mit ASON gegen IL-2 mrna Nach Behandlung mit ASON gegen IFN-γ mrna In vivo Daten für alle ASON Ausblick Zusammenfassung Literaturverzeichnis Publikationsliste Publikationen Poster/Vorträge Abkürzungsverzeichnis 143 Anhang
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