Hochdruckinduzierte Intermediate und denaturierte Zustände von Proteinen mit und ohne Cosolventien DISSERTATION

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1 Hochdruckinduzierte Intermediate und denaturierte Zustände von Proteinen mit und ohne Cosolventien DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.) eingereicht beim Fachbereich Chemie der Universität Dortmund von Heinz Herberhold aus Lippstadt Dortmund 2004

2 Vom Fachbereich Chemie der Universität Dortmund genehmigte Dissertation. Erstgutachter: Prof. Dr. R. Winter Zweitgutachter: Prof Dr. A. Geiger Tag der mündlichen Prüfung:

3 Berichte aus der Chemie Heinz Herberhold Hochdruckinduzierte Intermediate und denaturierte Zustände von Proteinen mit und ohne Cosolventien. D 290 (Diss. Universität Dortmund) Shaker Verlag Aachen 2004

4 Bibliografische Information der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet über abrufbar. Zugl.: Dortmund, Univ., Diss., Copyright Shaker Verlag 2004 Alle Rechte, auch das des auszugsweisen Nachdruckes, der auszugsweisen oder vollständigen Wiedergabe, der Speicherung in Datenverarbeitungsanlagen und der Übersetzung, vorbehalten. Printed in Germany. ISBN ISSN X Shaker Verlag GmbH Postfach Aachen Telefon: / Telefax: / Internet:

5 Danksagung Hiermit möchte ich mich bei all denen herzlichst bedanken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben: Mein Dank gilt zuallererst Herrn Prof. Dr. R. Winter für seine interessante Themenstellung und seine kompetente und wohlwollende Betreuung, welche maßgeblich Einfluss auf den Erfolg dieser Arbeit hatte. Für die freundliche Aufnahme am INSERM Unité 128 in Montpellier, Frankreich und für die hilfreiche Anleitung bei der Durchführung der Fluoreszenz- und UV/Vis-spektroskopischen Untersuchungen möchte ich mich bei Dr. Reinhard Lange und Stéphane Marchal bedanken. Für die Herstellung der Snase danke ich Frau Prof. Dr. C. A. Royer (Centre de Biochimie Structurale, Montpellier, Frankreich). Bei Herrn Prof. Dr. R. F. Vogel und Dr. Carsten H. Scheyhing (TU München, Freising, Weihenstephan) möchte ich mich für die Herstellung des rsgfp bedanken. Herrn Prof. Dr. A. Geiger danke ich für die Übernahme des Korreferats. Bei Sascha Janosch möchte ich mich für seine ständige und großartige Unterstützung, sowie für seine ständige Diskussionsbereitschaft bedanken, die ich ebenfalls von Dr. Claus Czeslik und Dr. Marion Börger erfahren habe. Bertina Schuppan danke ich für ihre außerordentliche Hilfsbereitschaft. Bei allen Mitarbeitern und Angehörigen des Arbeitskreises möchte ich mich für die angenehme und freundliche Arbeitsatmosphäre bedanken. Mein ganz besonderer Dank gilt nicht zuletzt meinen Eltern und Jasmin.

6

7 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung Proteine Aufbau der Proteine Einfluss von Druck auf Proteine Das p,t-zustandsdiagramm von Proteinen Proteinfaltung Einfluss von Cosolventien auf Proteine Protein/Cosolvens-Systeme unter Druck FTIR-Spektroskopie an Proteinen Sekundärstruktur und AmidI-Bande Entfaltung der AmidI-Bande Bestimmung der relativen Intensitäten der Sekundärstruktur Druckabhängigkeit der FTIR-Schwingungsbanden Fluoreszenz-Spektroskopie an Proteinen Fluoreszenz-Spektroskopie Biologische Fluorophore UV/Vis-Spektroskopie an Proteinen UV/Vis-Absorptionsspektroskopie Derivativ-UV/Vis-Spektroskopie Experimente Chemikalien Präparation FTIR-spektroskopische Untersuchungen UV/Vis-spektroskopische Untersuchungen Das Fluoreszenz-Untersuchungen...48

8 II Inhaltsverzeichnis 7 Ergebnisse Ubiquitin Temperaturabhängige Gleichgewichtsuntersuchungen Druckabhängige Gleichgewichtsuntersuchungen Kinetische Untersuchung der druckinduzierten Denaturierung Ergebnisse Grünfluoreszierendes Protein (GFP) Temperaturabhängige Messungen Druckinduzierte Denaturierung Druckinduzierter Vorübergang (Wasser-penetrierter Zustand) Ergebnisse Staphylokokken Nuklease (Snase) Einfluss von Saccharose auf die druckinduzierte Denaturierung Einfluss von Glycerol auf die druckinduzierte Denaturierung Einfluss von Sorbitol auf die druckinduzierte Denaturierung Einfluss von Harnstoff auf die druckinduzierte Denaturierung Einfluss von K 2SO 4 auf die druckinduzierte Denaturierung Einfluss von CaCl 2 auf die druckinduzierte Denaturierung Vergleich der einzelnen Cosolventien Ergebnisse Lysozym Temperaturabhängige Gleichgewichtsuntersuchungen Druckabhängige Gleichgewichtsuntersuchungen p,t-zustandsdiagramm Zusammenfassung Literatur...141

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