Untersuchungen zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Nanopartikein
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- Fanny Koch
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1 Berichte aus der Pharmazie Peter Ramge Untersuchungen zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Nanopartikein Shaker Verlag Aachen 1999
2 INHALTSVERZEICHNIS 1. HINTERGRUND UND ZIELSETZUNG DER ARBEIT 1 TEIL A: THEORETISCHE EINFÜHRUNG 4 2. DIE BLUT-HIRN-SCHRANKE Allgemeines Aufbau der Blut-Hirn-Schranke Funktion Blut-Hirn-Schranken-Modelle Strategien zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke Osmotische und chemische Öffnung Direkte Injektion in das Gehirn, das Rückenmark und osmotische Minipumpensysteme Induzierte Genexpression und Implantation von Gewebe Virale Transfektion Erleichterter Transport durch Antikörperkonjugate (AKK) Adsorption von Arzneistoffen an Polymere und Einkapselung lebender Zellen und Zeliinien Implantation lebender Zeliinien HDL/LDL ( high density" und Iow density lipoproteins") als Trägersystem zur Überwindung der Blut-Hirn-Schranke Insulinfragmente Liposomen und Nanopartikel Magnetische Mikrosphären Andere Methoden 26 Biochemische Modulation 26 Arzneistoffdesign und chemisch-pharmakologische Methoden 27 Genetische Modulation 28 Anpassung an die BHS im Tumorbereich DRUG TARGETING KOLLOIDALE ARZNEISTOFFTRÄGER I.Einleitung Definitionen 32
3 Nanopartikel Liposomen Andere kolloidale Arzneistoffträger Materialien und Herstellungsverfahren Nanopartikel Polyacrylate Eigenschaften und Verwendung von Nanopartikein Allgemeines Kontrolle der Wirkstoffreigabe und -Verteilung Überwindung der Blut-Hirn-Schranke mit Hilfe von Nanopartikein I.Vorarbeiten Tierversuche Plasmaadsorptionsmuster und deren Konsequenzen Geeignete Tiermodelle CHRONOPHARMAKOLOGIE I.Definitionen Chronopharmakologie Chronopharmakokinetik Chronopharmakodynamik Beispiel Blutdruck Das Schmerzempfinden Bedeutung für dieses Projekt 45 TEIL B: PRAKTISCHE ARBEITEN MATERIALIEN UND METHODEN MATERIALIEN UND GERÄTE Nanopartikel Chemikalien und Reagenzien Geräte Zellkulturen 48 II
4 RBE4-Zellinie Medium und Inkubationen Materialien und Geräte primäre Hirnendothelzellen Isolierung/Versuche , Medium Materialien und Geräte Cecchelli-Modell Medium und Inkubationen Materialien und Geräte Tierversuche EIGENSCHAFTEN UND QUANTITATIVE ANALYTIK DER VERWENDETEN ARZNEISTOFFE UND SUBSTANZEN LDalargin Paclitaxel (Taxol ) Rhodamin 6G NANOPARTIKEL Herstellung der Nanopartikel Polybutylcyanoacrylatnanopartikel (PBCA) PBCA-Nanopartikel mit Polysorbat 80 (P80) PBCA-Nanopartikel mit FITC-Dextran und 3 H-lnulin PBCA-Nanopartikel mit Rhodamin 6G PBCA-Nanopartikel mit Dalargin PBCA-Nanopartikel mit Paclitaxel C-Polymethylmethacrylatnanopartikel ( 14 C-PMMA) CHARAKTERISIERUNG DER NANOPARTIKEL Größenbestimmung Bestimmung des Polymergehaltes bei PBCA-NP ZELLKULTUR RBE4-Zellinie (rat brain endothelial-cell line) 61 III
5 Untersuchungen zur In-vitro-Toxizität von Nanopartikein mit Hilfe des MTT-Test Inkubationen mit 3 H-lnulin markierten PBCA-Nanopartikeln Inkubationen mit FITC-markierten PBCA-Nanopartikeln Primäre Rinderhirnendothetzellen Isolierung und Kultivierung MTT-Tests Immuncytochemische Charakterisierung Inkubationen mit Rhodamin 6G-markierten Nanopartikein Inhibitionsversuche zur Nanopartikelaufnahme 66 Filipin 66 LDL-Antikörper 67 Cvtochalasin 67 Colchicin 67 Lipoproteinarmes Fötales Kälberserum (FCS) Primäre Humanendothelzetlen Isolierung und Kultivierung MTT-Tests Immuncytochemische Charakterisierung Inkubationen mit Rhodamin 6G-markierten NP Primäre Mäusehirnendothelzellen Isolierung und Kultivierung Inkubationen In-vitro-Modell für die Blut-Hirn-Schranke (Cecchelli-Modell) Das Cecchelli-Modell Permeabilitätsassays mit PBCA-Nanopartikeln Inkubation mit 14 C-markierten PMMA-Nanopartikeln EM-Aufnahmen nach Inkubation von PBCA-Nanopartikeln TESTMETHODEN IM TIERVERSUCH Hot-Plate-Test Tail-Flick-Test TIERE LICR-Mäuse Anwendung verschiedener PBCA-Nanopartikelzubereitungen mit Dalargin und Polysorbat 80 im Tierversuch C-PMMA-Nanopartikel 76 IV Applikation von Trypanblaulösung und Nanopartikein DBA/2 und Balb/C Ermittlung des biologischen Rhythmus zweier Inzuchtmäusestämme Untersuchung zur Chronophanmakologie von verschiedenen Nanopartikelzubereitungen mit dem Hot-Plate-Test Untersuchungen zur dosis- und tageszeitabhängigen Wirkung von Nanopartikelzubereitungen mit dem Tail-Flick-Test maximal possible effect" (MPE) Das PHARMFIT-Programm ApoE-defiziente Mäuse und C57BL/6J-Stamm FLUORESZENZMIKROSKOPIE KONFOKALE LASER-SCANNING-MIKROSKOPIE (CLSM) TEILC 7. ERGEBNISSE 7.1. ANALYTIK Dalargin Eichgerade für Dalargin Beladungsrate für PBCA-Nanopartikel Paclitaxel Eichgerade für Paclitaxel Beladungsrate für PBCA-Nanopartikel Rhodamin 6G Eichgerade für Rhodamin 6G Beladungsrate für PBCA-Nanopartikel NANOPARTIKEL Polybutylcyanoacrylatnanopartikel Größenbestimmung, Ermittlung der mittleren Teilchengröße Wirkstofffreie PBCA- Nanopartikel Nanopartikel mit FITC-Dextran und 3 H-lnulin
6 Nanopartikel mit Dalargin Nanopartikel mit Paclitaxel Bestimmung des Polymergehalts Polymethylmethacrylatnanopartikel Größenbestimmung, Ermittlung der mittleren Teilchengröße C-PMMA- Nanopartikel ZELLBIOLOGISCHE VERSUCHE ISOLIERUNGEN Rinderhirnendothetzellen (Bovine Brain Capiiiary Endothelial Cells, BBCEC) Humane Hirnendothelzellen (Human Brain Capiiiary Endothelial Cells, HBCEC) Hirnendothelzellen murinen Ursprungs (Mice Brain Capiiiary Endothelial Cells, MBCEC) CHARAKTERISIERUNGEN Rinderhirnendothelzellen Hirnendothelzellen humanen Ursprungs MTT-TESTS RBE4-Zellinie Rinderhirnendothelzellen Hirnendothelzellen humanen Ursprungs INKUBATIONEN RBE4-Zellinie H-lnulin-markierte Nanopartikel FITC-markierte Nanopartikel Inkubationen auf Rinderhirnendothelzellen Rhodamin 6G-markierte Nanopartikel Inhibitionsversuche der Nanopartikelaufnahme 106 Filipin LDL-Antikörper Cytochalasin Colchicin Lipoproteinarmes Fötales Kälberserum Hirnendothelzellen humanen Ursprungs Rhodamin 6G-markierte Nanopartikel Murine Hirnendothelzellen Rhodamin 6G-markierte Nanopartikel Cecchelli-Modell Permeabilitätsassays mit PBCA-Nanopartikeln Elektronenmikroskopische Aufnahmen C-PMMA-Nanopartikel 7.4. IN-VIVO-VERSUCHE MIT 14 C-MARKIERTEN PMMA-NANOPARTIKELN Alkaltne Phosphatase Assay "C-PMMA-Verteilung im Gehirngewebe von Mäusen ICR-MÄUSE PBCA-Nanopartikelzubereitungen Trypanblaulösung und Nanopartikel UNTERSUCHUNGEN MIT APOE-DEFIZIENTEN MÄUSEN CHRONOPHARMAKOLOGIE Schmerzempfinden in Abhängigkeit von der Tageszeit bei DBA/2 und Balb/c-Mäusen Chronopharmakologische Untersuchung von verschiedenen Nanopartikelzubereitungen Dosis/Wirkungstestung mit dem Tail-Flick-Test zu zwei Zeitpunkten TEIL D: DISKUSSION VI vn
7 8.1. HERSTELLUNG UND EIGENSCHAFTEN DER VERWENDETEN NANOPARTIKEL Nanopartikel mit adsorptiver Bindung von Wirkstoffen Nanopartikel mit inkorporativer Bindung von Wirkstoffen ZELLULÄRE ANREICHERUNG UND MECHANISMEN RBE4-Zellinle Primäre Endothelzellkulturen Cecchelli-Modell VERSUCHE MIT ICR-MÄUSEN Wirkung von NP-Zubereitungen Verteilungsstudien im Gehirn mit "C-PMMA-Nanopartikeln Trypanblaulösung APOE-DEFIZIENTE MÄUSE CHRONOPHARMAKOLOGIE SCHLUßFOLGERUNG UND AUSBLICK 157 ZUSAMMENFASSUNG 159 LITERATURVERZEICHNIS 162 ANHANG 170 Lebenslauf 170 Publikationen und Kongreßbeiträge 171 VIII
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