Fluoreszenzmikroskopie und Probenpräparation
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- Günter Blau
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1 Lehrerfortbildung Nanobiotechnologie Fluoreszenzmikroskopie und Probenpräparation Dr. Martin Oberringer Abt. für Unfall-, Hand- und Wiederherstellungschirurgie Homburg Fachrichtung Experimentalphysik Saarbrücken
2 Lehrerfortbildung Nanobiotechnologie Fluoreszenzmikroskopie und Probenpräparation - Begriffserklärungen - Apparative Vorraussetzungen Aufbau - Auflicht-Fluoreszenz-Anregung Filteraufbau Filtertypen Fluorochrome/ Filtersätze - Beispiele biologischer Anwendungen - Immunfluoreszenz Begriffserklärungen Färbeprinzip - Verwendete Antikörper Spezifität - Färbeprotokoll - Auswertung Mikroskopieren Dokumentieren Bildnachbearbeitung
3 Fluoreszenzmikroskopie Begriffserklärungen Lumineszenz: Unter Lumineszenz versteht man den Prozeß, bei dem durch unterschiedliche Vorgänge elektromagnetische Strahlung im Bereich des sichtbaren Lichts emittiert wird. Fluoreszenz: Die Lumineszenz endet unmittelbar nach Beendigung der Anregung. Phosphoreszenz: Da die Lichtemission die Zeit der Einwirkung der Lichterregung überdauert, kommt es zum Nachleuchten. (Zwischenstufe der Elektronen beim Übergang vom angeregten in den Grundzustand).
4 Fluoreszenzmikroskopie Begriffserklärungen Photolumineszenz: Durch die Anregung im UV-, IR- oder sichtbaren Bereich wird eine Lichtemission ausgelöst. Chemolumineszenz: Energie der Reaktion wird als Lichtemission frei. Biolumineszenz: (besondere Art der Chemolumineszenz) Emission nach enzymatische Reaktionen aus Flora und Fauna. -andere: Tribolumineszenz, Kathodenlumineszenz, Radiolumineszenz
5 Fluoreszenzmikroskopie Apparative Vorraussetzungen/ Auflicht-Fluoreszenz-Anregung Strahlengang 4 1 Hg-Dampfhochdrucklampe 2 Filterwürfel 2a Anregungsfilter 2b Teilerspiegel (dichroischer Spiegel) 2c Emissionsfilter 3 Fluoreszierende Probe 4 Betrachter/ Kamera 2b 2c 2 2a 3 1
6 Fluoreszenzmikroskopie Auflicht-Fluoreszenz-Anregung Filtertypen Bandpass Fluoresceinisothiocyanat (488nm/ 525nm) (FITC) Longpass DAPI (359nm/ 461nm) Quelle:
7 Fluoreszenzmikroskopie Auflicht-Fluoreszenz-Anregung Fluorochrome/ Filtersätze Bandpass Cy3 (552nm/ 570nm) Triple Bandpass FITC, Cy3, DAPI Quelle:
8 Fluoreszenzmikroskopie Beispiele biologischer Anwendungen Chromosom Sonden-DNA Denaturierung DNA-Helix Chromosomen- Sonde Denaturierung Ziel-DNA Fluoreszenz in situ-hybridisierung (FISH) mit Zentromersonden, Cy3 und FITC markiert, Kern-Gegenfärbung mit DAPI
9 Fluoreszenzmikroskopie Beispiele biologischer Anwendungen Immunfluoreszenzfärbung Mib-Ki67-Cy3 (+ FISH) Immunfluoreszenzfärbung vwf-cy3
10 Probenpräparation Immunfluoreszenz Begriffserklärungen/ Färbeprinzip Direkte Färbung Indirekte Färbung Markierter Antikörper Antigen Markierter (Zweit-)Antikörper Unmarkierter Antikörper
11 Probenpräparation Verwendete Antikörper 1. Ki67 - Im Zellkern - Proliferationsassoziiertes Antigen - In den Zellzyklusphasen späte G1 Mitose - Erlaubt die Identifkation von ruhenden und proliferierenden Zellen in Gewebeschnitten oder Zellkulturen G0 G1 2. Von Willebrand Faktor (Faktor VIII related antigen) - Multimeres Glycoprotein - Bindet andere Glycoproteine, Kollagen und Heparin - Schutz von Faktor VIII vor unspezifischem Abbau - Vermittelt die Adhäsion von Thrombozyten - Gespeichert in Weibel-Pallade-Körperchen - Erlaubt die Charakterisierung vom Endothelzellen
12 Probenpräparation Verwendete Zellen Gewebestücke Immunfluoreszenzfärbung Kollagenase- Verdau Kultivierung in Quadriperm-Schalen Zell-Fixierung
13 Probenpräparation Färbeprotokoll Ki67 HDMEC Primär-AK: Ki67 (Maus) Sekundär-AK: Ziege-anti-Maus-Cy3 FISH und Kern-Gegenfärbung Trocknen :: ::::
14 Probenpräparation Färbeprotokoll vwf HDMEC Primär-AK: vwf (Kaninchen) Sekundär-AK: Ziege-anti-Kaninchen-Cy3 Trocknen
15 Proben Auswertung Mikroskopieren -Einführung -Erklärung der Komponenten -Präparate: Ki67-Cy3 mit FISH und Kerngegenfärbung vwf-cy3 mit Kerngegenfärbung -Auszählen der positiven Zellen und Ermittlung des prozentualen Anteils -Auszählen der FISH-Signale
16 Proben Auswertung Dokumentieren -Protokoll der Auswertung: Auszählen der positiven Zellen und Ermittlung des prozentualen Anteils Auszählen der FISH-Signale Ki67 Diploide Polyploide Positive Negative -Bildaufnahme
17 Proben Auswertung Bildnachbearbeitung
18 Organisation/ Gruppeneinteilung
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