FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE. Biophysik Vorlesung Gábor Talián

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1 FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE Biophysik Vorlesung Gábor Talián

2 ENTWURF Lumineszenz Fluoreszenzvorgang Fluorimeter Charakterisierung der Fluoreszenz Fluorophore, Biolumineszenz

3 Lumineszenz Elektronenanregung Energieüberfluß Der wird nicht konserviert: Energieabgabe z.b. Photonenemission = LUMINESZENZ ihr Grund ist nicht die hohe Temperatur des Körpers ( kalte Emission Temperaturstrahlung)

4 Anregunsweise Typ der Lumineszenz Photonenabsorption Chemische Reaktion Wärme Ladungszufuhr Hochenergetisierte Teilchenstrahlung Reibung Schallwelle Photolumineszenz Chemilumineszenz, Biolumineszenz Termolumineszenz Elektrolumineszenz Radiolumineszenz Tribolumineszenz Sonolumineszenz Angeregter Zustand Radiative Relaxation Erster angeregter Singlett Fluoreszenz, verspätete Fluoreszenz Niedrigster Triplett Phosphoreszenz

5 S 3 S 3 interner Übergang/ innere Umwandlung S 2 S 2 strahlungslos Schwingungsrelaxation S 1 S 1 S 0 S 0 e - + hν 1 e - * e - + hν 2 ν 1 = ν 2 Fluoreszenz

6 FLUORESZENZVORGANG 1.) Das Elektron eines Moleküls in S 0 Grundzustand wird mit angeregt. S 3 2.) Es gelangt in S 1 Zustand (selten in S 2 [S n ]). Umwandlungsdauer : ~ s Die Photonenabsorption verändert den Spinzustand nicht. Das System strebt nach dem Grundzustand. 2 3.) Das angeregte Elektron wird vom S n Zustand auf S 1 relaxier durch strahlunslosen internen Übergang / innere Umwandlung. Die freigesetzte Energie wird als Vibration verteilt. S ) Das Elektron gelangt immer auf das niedrigste Vibrationsniveau des ersten angeregten Zustands (S 1 ): Kasha-Regel. Die freigesetzte Energie wird mit der Umgebung als Wärme getauscht: Vibrations- oder termische Relaxation. S Umwandlungsdauer von Schritten 3-4 : ~ s 5.) Das Elektron von dem ersten angeregten Zustand (S 1 ) kehrt in den Grundzustand (S 0 ) zurück durch radiative Relaxation, d. h., Photonenemission: Lumineszenz S 0 Umwandlungsdauer : ~ s Michael Kasha, USA,

7 Übergang in S 0 A.) FLUORESZENZ: in einem Schritt Umwandlungsdauer : ~ s B.) PHOSPHORESZENZ: strahlungloser Übergang in den Triplettzustand (T 1 ) Intersystem crossing Umwandlungsdauer : ~ s Das angeregte Elektron von T 1 kehrt in den Grundzustand (S 0 ) zurück durch radiative Relaxation, d. h., Photonenemission: Lumineszenz S 2 Sehr kleine Wahrscheinlichkeit wegen der verbotenen Spinumwandlung Umwandlungsdauer : ~ s C.) VERSPÄTETE FLUORESZENZ: Das Elektron von T 1 gelangt in den ersten angeregten Zustand (S 1 ) durch termische Anregung S 1 C T 1 A B S 0 gleicher Spinzustand entgegengesetzter Spinzustand

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9 Messung der Fluoreszenz: Der Fluorimeter Die Küvette Durchschaulich Nichtfluoreszierender Stoff Glas im sichtbaren Bereich Spezialglas für λ <300 nm Quarz für Absorption (polarisierend!) Spezialquarz für Fluoreszenz Durchflußküvette

10 Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz: Lässt sich gut detektieren meßbar auch bei kleinen Konzentrationen Empfindlich auf die Umgebung und Wechselvirkungen Parameter der Lumineszenzstoffe Anregungs- und Emmissionsspektrum Quantenausbeute Lebensdauer des angeregten Zustands Polarisation/Anisotropie

11 Emissonsspektrum J E / λ (λ)

12 SPEKTRA ANREGUNG Bei einer festgestellten Emissionswellenlänge (höchste Intensität) IntensitätalsFunktionder Anregungswellenlänge Übergänge vom Grundzustand S 0 S N FLUORESZENZ Bei einer festgestellten Absorptionswellenlänge (höchste Intensität) IntensitätalsFunktionder Emissionswellenlänge Übergänge vom niedrigsten Schwingungsniveau des ersten angeregten Zustands S 1 S 0 PHOSPHORESZENZ Bei einer festgestellten Absorptionswellenlänge (höchste Intensität) IntensitätalsFunktionder Emissionswellenlänge Übergänge vom niedrigsten Schwingungsniveau des ersten Triplettzustands T 1 S 0 Stokes-shift (Verschiebung) George Gabriel Stokes, ENG, Spiegelsymmetrie Anregung Absorp on!

13 QUANTENAUSBEUTE Φ= <1 FLUORESZENZLEBENSDAUER Intensität Anregungsimpuls Fluoreszenz = Lebensdauer Zeit

14 FLUORESZENZFARBSTOFFE Spezifische Markierungen an Molekülen Kromophor - chemische Substanz geeignet zur Lumineszenz Fluorophor - chemische Substanz geeignet zur Fluoreszenz Native/Innere/Intrinsic Fluorophore - aromatische Aminosäuren kein Bedarf das Protein zu verändern Äußere/Extrinsic Fluorophore IAEDANS IAF FITC Fluoreszein

15 Toxine Makrophag-Markierung Falloidin B-Skorpionentoxin A-Bungarotoxin Aktin: Phalloidin-Alexa 568 (rot) Zellkerne: DAPI (lila) Streptococcus aureus (grün) Antikörper Oder fluoreszierende Markierung Maus, embryonelle Fibroblastzelle, Interphase Tubulin: polyklonale Antikörper-Markierung (grün) DNS : blau

16 BIOLUMINESZENZ Leuchtkäfer (Lampyris noctiluca) Siphonophora; Praya dubia Luciferin + ATP Luciferil-adenilat + PP i Luciferil-adenilat+O 2 Peroxiluciferin + AMP Peroxiluciferin Oxiluciferin + hν Ctenophora; Bathocyroë

17 Green fluorescent protein (GFP) Shimomura, Johnson, Saiga (1962) Nobel-Preis in 2008 Aequorea victoria Aequorin (22 kda) Green fluorescent protein (27 kda)

18 GFP Derivate (ECFP,YFP,..) relative Fluoreszenz relative Fluoreszenz Wellenlänge (nm) Wellenlänge (nm)

19 ZUSAMMENFASSUNG Lumineszenz - Lichtausstrahlung nach nicht-termischer Anregung Fluoreszenz und Phosphoreszenz (Übergänge zwischen Elektronenenergieniveaus, Kasha-Regel, Singulett- und Triplettzustände) Fluorimeter Anregungs- und Emissions(Fluoreszenz-)spektra; Stokes-shift Quantenausbeute, Lebensdauer, Fluoreszenzabklang Fluorophore, Biolumineszenz, Verwendungen

20 Danke für Ihre Aufmerksamkeit!

21 Rot fluoreszierende Anemone bei Tageslicht

22 Seeigel

23 Anemonen

24 1955 wurde das später Green Fluorescent Protein (GFP) getaufte Pigment erstmals beschrieben und als Protein erkannt wurde es erstmals aus der Qualle Aequorea victoria isoliert wurde Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien gemeinsam der Nobelpreis für Chemie verliehen für die Entdeckung und Entwicklung des Green Fluorescent Protein, GFP

25 Green Fluorescent Protein (GFP)

26 Drsophila with GFP Transmission of a GFP transgene directed by actin promoter from a transgenic mother to one of her 3 pups.

27 FluoreszendeBiomoleküle(Sonden) Anwendungsbeispiele: 1. Aromatische Aminosäuren: Tryptophan, Tyrosin, Phenyl-alanin 2. Proteinen mit aromatische Aminosäuren(Absorption 280 nm, Emission nm ) 3. GFP (YFP, RFP ) Mit geeigneten mikroskopischen Verfahren, wie z. B. der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, lassen sich damit biologische Vorgänge innerhalb der Zellen sichtbar machen. 4. Porphyrinen(Häm and Chlorophyll) Stoffwechselerkrankungen, Photosynteseaktivitat 5. Vitamin A (Carotinoide) 6. Einige Steroide 7. Künstliche Fluorophore -Ethidiumbromid(Bindungan DNA) - Extrinsische Fluorophore

28 Polarlicht ist auch Fluoreszenz beidemdie Anregungder Luftmolekülein ersterliniedurchdie Teilchendes Sonnenwindes erfolgt, bei dem infolge der Wechselwirkung mit dem Sonnenwind Moleküle Licht ausstrahlen. Green light the northern lights in Canada. Photograph: Daniel J Cox/Corbis

29 a geomagnetic storm caused Northern Lights to be visible in Europe at unusually low latitudes. a photo taken from the International Space Station

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