Fluoreszenzintensität ist proportional zur Konzentration angeregter Moleküle. Zeitliche Änderung der Konzentration angeregter Moleküle:

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Kilian Melsbach
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1 Fluoreszenzintensität ist proportional zur Konzentration angeregter Moleküle Zeitliche Änderung der Konzentration angeregter Moleküle: d[s 1 ] dt = k rad [S 1 ] k ic [S 1 ] k isc [S 1 ]... = 1 [S 1] Integration ergibt exponentiellen Abfall: [S 1 ]=[S 1 ] 0 e t/! I = I 0 e t/ 1 Fluoreszenzintensität k fl k rad Zeit (ns) 8 10 Fluoreszenzquantenausbeute ist definiert als Zahl emittierter Photonen durch Zahl absorbierter Photonen: f = N em N abs = k rad[s 1 ] [S 1 ] P k = k rad k rad + k ic + k isc +... Bestimmung der Fluoreszenzquantenausbeute: Vergleich mit Substanz mit bekanntem Ref f Konzentration so, dass gleiche Absorption 67

2 Emissionsspektrum integrieren Quantenausbeute ist dann: X f = R I X em R I Ref em Ref f Messung von Fluoreszenzabklingzeiten TCSPC (Time correlated single photon counting) Anregung mit gepulstem Laser Detektion einzelner Photonen Zeitmessung und Histogrammierung der Zeitdifferenzen Puls- Photon Reversed Start-Stop, damit Uhr nicht so oft gestartet werden muss Sehr empfindlich Pile-Up Problem! Zu hohe Emissionsrate: Detektion falscher Photonen 13.3 Fluorophore Bezeichnung für Moleküle, die fluoreszieren können Oberbegriff für Farbstoffe: Chromophore 68

3 Im VIS-Bereich nahezu ausschliesslich konjugierte -Elektronensysteme Intrinsische Damit sind solche Fluorophore gemeint, die in biologischen (Makro-) Molekülen vorkommen Es gibt fluoreszierende Aminosäuren und Nukleinsäuren 69

4 GFP: Green fluorescent protein, aus der Tiefseequalle Aquorea Victoria Fluorophor geschützt im Innern einer Fass-Struktur 70

auf Umgebung spezielle Kopplungsgruppen (zur Kopplung an Amino- oder

5 Synthetische Fluorophore Möglichst hohe Fluoreszenzquantenausbeute je nach Fragestellung: Gute Löslichkeit geringe oder hohe Sensitivität auf Umgebung spezielle Kopplungsgruppen (zur Kopplung an Amino- oder Mercapto- Gruppen oder Einlagerung in Lipide) Proteinlabels: Wasserlöslich 71

6 FlAsH Labeling Lipidmarker: Fettsäureketten und polarer (wasserlöslicher) Farbstoff 72

7 73

8 13.4 Energieübertragung Resonanzenergietransfer (Förster)- Spektroskopisches Lineal Theodor Förster: Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz (gleiche Farbstoffe) Stryer, Haugland: Energy transfer: a spectroscopic ruler (unterschiedliche Farbstoffe) Dipol im Feld eines Dipols: H = ~µ A ED ~ 3 ~µ D ˆ~r ˆ~r ~µ D = ~µ A r 3 ~µ A ~µ D 3 ~µ Aˆ~r ~µ Dˆ~r = r 3 = apple ~µ D ~µ A /r 3 mit apple =2cos D cos A sin D sin A cos Transferrate quantenmechanisch: Fermi s Golden Rule: k T / h DA H D Ai 2 H ist hierbei die Dipol-Dipol-Wechselwirkung Nach einiger Rechnung erhält man: k t = 1 1 apple 2 Z 9ln(10) 0 r 6 n 4 N A d f D ( ) A ( )/ 4 0 ist Fluoreszenzabklingzeit ohne Transfer, also der Kehrwert der Summe aller Raten aus S 1 ohne Transfer 74

9 Abstandsabhängigkeit: k t / r 6 Orientierungsabhängigkeit Überlappungsintegral R d f D ( ) A ( )/ 4 Auswahlregeln: Auch spinverbotene Übergänge erlaubt! Klassische Betrachtung: Akzeptor_Dipol viel kleiner als Wellenlänge -> kein Unterschied ob Welle oder Wechselfeld Absorption proportional zu Intensität proportional zum Quadrat des E-Feldes projiziert auf Dipolachse Absorption proportional zu Wirkungsquerschnitt -> Absorptionsspektrum E-Feld proportional zu 1/r 3 -> Abstandsabhängigkeit E-Feld proportional zu Emissionswahrscheinlichkeit -> Emissionsspektrum Mit dem Försterradius r 0 s Z apple r 0 = 2 9ln(10) 6 n 4 N A d f D ( ) A ( )/ 4 folgt k t = 1 0 r 6 0 r 6 Abstand Donor-Akzeptor gleich Försterradius: Transferrate gleich inverser Fluoreszenzlebensdauer Häufiger verwendet: Transfereffizienz E t,dasistdasverhältnisderauf den Akzeptor übertragenen Energiequanten zur Zahl der Anregungen: E t = kt 1/ 0 +k t = (r 0/r) 6 1+(r 0 /r) 6 Transfereffizienz bei r = r 0 : E t =0.5 Experimentelle Bestimmung der Transferrate: 75

10 1. Messung der Fluoreszenzintensitäten von Donor (F D )undakzeptor (F A ): F A E t = F D + F A 2. Messung der Fluoreszenzintensität des Donors ohne Akzeptor (FD 0 )und mit Akzeptor (FD A) FD A Et =1 FD 0 3. Messung der Fluoreszenzlebensdauer des Donors ohne Akzeptor ( D 0 ) und mit Akzeptor ( D A) D A Et =1 D 0 Die Messung über die Fluoreszenzlebensdauern ist besonders robust Hat man mehrere Spezies vorliegen, haben die Donoren verschiedene Fluoreszenzlebensdauern Eine Messung mit TCSPC liefert mehrere Komponenten (Summe exponentieller Zerfälle): Identifikation der Spezies möglich Diese Methode heisst time-resolved FRET (tr-fret) 13.5 Quenching Stern-Volmer Gleichung: F 0 F 1=K SV [Q] [Q]? F 0 Fluoreszenzintensität ohne Quenching, F mit Quenching, K SV Stern- Volmer Konstante dynamisches Quenching: Bei Annäherung eines sog. Quenchermoleküls kann die Anregungsenergie auf dieses übertragen werden -> Änderung der Fluoreszenz-Quantenausbeute 76

11 Zusätzlicher Abregungspfad mit k Q,dadurchVerkürzungderFluoreszenzabklingzeit Fluoreszenzquantenausbeute mit Quenching: Q = k rad k rad + k nrad + [Q] [Q]? k Q Es gilt F 0 F = 0 Q Damit folgt mit 0 =(k rad + k nrad ) 1 : K SV = k Q 0 statisches Quenching: Bildung eines nicht fluoreszierenden Komplexes im Grundzustand -> Änderung der Konzentration des leuchtfähigen Farbstoffes F+Q FQ K SV = K = [FQ] [F][Q] 77

12 14 Spinresonanzspektroskopie 14.1 Spin Eigenschaft von Fermionen von der Dimension eines Drehimpulses ( ~ S), das zu einem messbaren magnetischen Moment führt Messung nur durch Wechselwirkung mit einem B-Feld möglich, damit ausgezeichnete Richtung Experimentelle Befunde: Magnetisches Moment in Richtung B-Feld ( B ~ zeige in Richtung z-achse): ~µ = S Z = m S ~ mit S Z : z-komponente des Spins, m S : magnetische Quantenzahl, :gyromagnetischesverhältnis m S = S, S +1...S 1,S mit S als der Spinquantenzahl ~ S 2 = ~ 2 S(S +1) Für Fermionen (Elektron, Proton, Neutron) S = 1 2 Für das gyromagnetische Verhältnis gilt: = gµ B ~, wobei das Bohrsche Magneton µ B = q~ 2m = g q 2m beträgt, womit g ist der gyromagnetische Faktor oder auch Landé-Faktor 14.2 Energie im B - Feld E = ~µ ~B = m s ~B 0 Energieaufspaltung im Magnetfeld: E = ~! L = ~ B 0 78

13 E β m S =-1/2 α m S =1/2 B 0 Der Vektor ~ S und damit auch ~µ präzediert im magnetischen Feld um den Feldvektor ~ B 0 mit der Larmorfrequenz! L = B 0 Einstrahlung von EM Wellen bei der Larmorfrequenz führt zu Resonanzabsorption Besetzungsstatistik N = e ~ B0 kt N Bei Einstrahlung ausreichend intensiver Radiowellen: Ausgleich der Besetzungsdifferenz (Sättigung) Relaxationsmöglichkeiten: Stösse mit Umgebung (Spin-Gitter-Relaxation, longitudinale Relaxation) Unterschiedliche Larmorfrequenzen der einzelnen Spins: Spin-Spin oder transversale Relaxation) Kopplung von Spins: 79

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