Physik und Photosynthese

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1 Physik und Photosynthese F.-J.Schmitt Optisches Institut der Technischen Universität Berlin

2 Table of Contents 1) Physik Molekülspektren und Fluoreszenz Gekoppelte Pigmente Zeit- und Wellenlängenaufgelöste Fluoreszenzspektroskopie 2) Photosynthese Bedeutung der Photosynthese Die ersten photosynthetischen Schritte Aufbau der pflanzlichen Lichtsammelsysteme Das Cyanobakterium Acaryochloris marina Fluoreszenzspektroskopische Ergebnisse an A.marina Konstruktion eines Modells für den Anregungsenergietransfer Zusammenfassung / Ausblick

3 Fluoreszenz sind Photonen, welche beim Zerfall angeregter Zustände emittiert werden zum Beispiel - sichtbares Fluoreszenzlicht (auch Phosphoreszenz) - Röntgenfluoreszenz

4 Molekülspektren Chlorophyll Phycocyanobilin an Biliprotein Dichtes Spektrum von Schwingungszuständen -> Breite Emissionsbänder π Elektronen-System -> S 1 - Zustand mit langer Lebensdauer (5 ns) im optischen Bereich -> sichtbare Fluoreszenz (auch bei UV- Anregung)

5 E Jablonski Diagram von Chlorophyll Tn Sn S 3 k IC S 2 T 1 k O 2 k IC k Carot k Phos k k ISC S IC 1 k ISC k Annihil k Flour k Flour k ET k IC k IC k k ET ET k IC Absorption S 0 k IC

6 Lebensdauer und Fluoreszenzintensität d S dt 1 = ( kfluor + k Annihil + ket + kic + kisc ) S1 S 1 ( t ) t ( kfluor + k Annihil + ket + kic + kisc ) t τ = S ( ) e : = S ( 0 ) e τ = 1 k + k + k + k + Flour Annihil ET IC k ISC F( t ) = kflour S1 ( t ) Monoexponenzielles Abklingen der Fluoreszenz bei einem angeregten (delokalisierten Zustand) (trotz dissipativer Kanäle) Φ = k τ : = F : Flour τ τ 0

7 Gekoppelte Systeme benachbarte Pigmente können Anregungsenergie übertragen Intensity [rel. u.] 660 nm 725 nm dn ( t) Decay associated spectra (γ 1 ) -1 = τ 1 (slow) (γ 2 ) -1 = τ 2 (fast) Wavelength [nm] 1 dt dn2 dt ( t) = = ( k k ) N ( t) + k N ( t) k N N i ( t) + ( k k ) N ( t) n ( 0) = j= 1 n ( t) = j= 1 21 N i U ij F i U ij e ( t) = k N ( t) Fluor γ j t i 2 2

8 F i ( t) = k N ( t) Fluor i F i n ( t) = k Fluor j= 1 U ij e γ j t Information des Kopplungszustands der Pigmente wird in der Dynamik des Fluoreszenzlichtes abgebildet dazu: spektrale und zeitliche Information nötig In der Photosynthese sind die Kopplungszustände der beteiligten Pigment- Protein- Komplexe noch nicht vollständig aufgeklärt

9 Charakteristische Fluoreszenzspektren - spezifisch für verschiedene Pigmente Abhängig von - Anregungswellenlänge - Temperatur Fazit: Selektive Pigmentidentifikation möglich

10 Absorptionsspektren von Chl a und Chl d 404 nm (Chl d) 430 nm (Chl a) 450 nm (Chl d) 632 nm (PC, APC) 654 nm (Chl a)

11 Technik des zeit- und wellenlängenaufgelösten Single- Photon-Countings 632 nm Fluoreszenzspektroskopie schnell nicht invasiv F(t,λ) > Zeit- und Wellenlängeninformation

12 Datenanalyse Color Intensity Plot Wavelength [nm] Color Intensity Time [ns] Intensity [rel. u.] Time [ns]

13 Decay Associated Spectra (DAS) F Plot der anfänglichen Amplituden als Funktion von l (bei gekoppelten Zeitkonstanten) ( ) ( ) ( t τ ) i λ, t a λ e = i i

14 Photosynthese Photosynthese ist der bedeutendste biochemische Prozess auf der Welt 11 (Produktion an Biomasse 5 10 t / year) der weltweite Energieverbrauch durch den Menschen entspricht 0,01 % der Energie der jährlichen direkten Sonneneinstrahlung

15 Lichtsammelsysteme (Antennensysteme) und Reaktionszentrum (schematisch) Licht Pigment moleküle Antennensystem Reaktionszentrum

16 Pigmente im Antennensystem

17 Energetische Lage der einzelnen Kompartimente

18 Photosystem II

19 Photosystem I

20 Acaryochloris marina Externes Antennensystem Licht Pigment-Protein Komplexe (Membran)-internes Antennensystem e - - Donor e - - Akzeptor Reaktionszentrum

21 A.marina - natürlicher Lebensraum Ascidia im Great Barrier reef Marquardt et al., FEBS letters 1997, ARCH Microbiol., 2000 Miyashita et al., Nature 383, 1996

22 Anregungsenergietransfer in A. marina Wavelength [nm] F ( ) ( ) ( t τ ) i λ, t a λ e = i i Time [ns]

23 Fluoreszenzdynamik in A.marina Wavelength [nm] Time [ns] Intensity [rel. u.] Decay associated spectra Time [ns] Intensity [rel. u.] PC APC Chl d Wavelength [nm]

24 Absorption von Chl d and PBP Hu et al., Biochimica et Biophys acta, 1999

25 DAS 654 nm Anregungswellenlänge, 10 K Kaum Absorption durch PBP kein PBP - Chld Anregungsenergietransfer

26 DAS 632 nm Anregungswellenlänge, 10 K Energietransfer PBP - Chld (100 ps)

27 Bei Raumtemperatur ist der Anregungsenergietransfer schwer aufzulösen: - schnelle Komponenten mit positiver Amplitude bei 725 nm - direkte Chl d Anregung bei 632 nm - sehr schneller Anregungsenergietransfer bei Raumtemp. (nahe am Auflösungsvermögen) Lösung: - einzelne Auswertung der PBP und Chl d Fluoreszenz - Analyse der Abweichungen (Residuen) zwischen Anpassung und Messung - spektraler Fit der gefundenen Emissionsbanden - Statistik - selektive Anregung der PBP (bei 600 nm)

28 Fit von 3 Wellenlängensektionen (647 nm, 665 nm, 725 nm) 1 global angepasste Komponente Wavelength [nm] Time [ns] Intensity [rel. u.] Time [ns] 4 Komponenten bei nm Time [ns] Time [ns]

29 Spektraler Fit der Fluoreszenzemissionsbanden Lorentz Gauß 647 nm, PC (70 ps) 665 nm, APC (70 ps) 725 nm / 740 nm Chl d Anstiegskinetik (70 ps) 723 nm Chl d (630 ps) 727 nm Chl d (130 ps) Intensity [rel. u.] Durchschnitt (6 Messungen) Wavelength [nm]

30 600 nm Anregungswellenlänge, 298 K Energy transfer PBP -> Chld (30-70 ps)

31 Zahlreiche Fragestellungen sind nicht beantwortet Welche Fluoreszenzanteile entsammen tatsächlich dem PS II und dort den Pigmenten, welche nach unserer Annahme gekoppelt sind (PC, APC, Chl d)? Welche Anregungsenergietransferraten resultieren aus den beobachteten Fluoreszenzkomponenten? (eine eindeutige Abbildung existiert hier nicht!) Wie sensitiv reagieren diese Transferraten bei einer Variation der mit Fehlern behafteten Fluoreszenzzeiten? Wie ist die molekulare Anordnung der Pigmente den Anregungsenergietransferraten entsprechend?

32 PS I / PS II Fluorescence Elektronentransport im PS II [Schatz,88] Auswirkung von 20 µm DCMU 130 ps : 90 % PS I 630 ps : 100 % PS II

33 Anregungsenergietransfer im PS II (offene RC)

34 Ladungstrennung: 600 ps in A.marina (Spinat: 230 ps [Bergmann]) (Höherer energetischer Zustand des primären Donormoleküls?) Erwartung experimentell Intensity [rel. [%] u.] Intensity [%] Pigment Energietransfer PBP - Chld 60 ps! Effizienz: 97 % Auflösungsvermögen 30 ps!

35 Wavelength [nm] Intensity [rel. u.] Entkopplung der externen Antennensysteme bei 0 C 5 C C K (15 (240 (5 min.) min.) Time [ns] 0 C (240 min.) 25 C Intensity [rel. u.] 0 C (240 min.) 25 C Wavelength [nm] Time [ns] nach 240 min. bei 0 C 75 % der PBP Antennen entkoppelt

36 k fret Theorie des Anregungsenergietransfers Foerster Resonanz Energie Transfer (FRET) ( ) D ( ) ( ) 4 r = F λ ε λ λ dλ τ AQ D R κ n 4 0 D A 3,3 nm Wavelength [nm] R0 E = ~ 97% 6 6 R + R E R12 = R0 = 3, 3nm E 1 6

37 Stabilität der Lösung für R 12 R in Abhäng. von 12 n and κ 2 ( ε ) 3, nm R ( ε ) 3, 7 nm R = 12 1 =

38 Summary 647 nm Band PC, 665 nm APC, 725 nm Chl d PC/APC? Chl d Anregungsenergietransfer (τ 60 ps) viel schnellerer Anregungsenergietransfer als in anderen Cyanobakterien (Synechococcus ~ 200ps) Effizienz ~ 97 % (teilweise reversibles) Entkoppeln der PBP Antennen bei 0 C Foerster Resonanz Energie Transfer? R 12 ~ 3,3 nm 632 nm R 12 ~ 3,3 nm E ~ 97 % 25 ps 60 ps 647 nm 665 nm 725 nm 90 % 630 ps : PSII 10 % 130 ps : PSII

39 Weitere Anwendungsmöglichkeiten Präparationsprozesskontrolle Detektion / Analyse von Proteinaktivität Untersuchung der Photosyntheseaktivität bei verschiedensten Umgebungseinflüssen Qualitätskontrolle an frischen Lebensmitteln (viele toxische Substanzen fluoreszieren (Pilze)) Kontaminationskontrolle (Fleischindustrie) Rückstandskontrolle (Pharmazeutik)

40 Zdenek Petrášek, Franz-Josef Schmitt, Christoph Theiss, Joachim Huyer, Min Chen, Anthony Larkum, Hans Joachim Eichler, Klaus Kemnitz and Hann-Jörg Eckert, Excitation energy transfer from phycobiliprotein to chlorophyll d in intact cells of Acaryochloris marina studied by time- and wavelength resolved fluorescence spectroscopy, Photochemical & Photobiological Sciences, 2005, in press Vielen Dank an: Dr. Hann-Jörg Eckert, Joachim Huyer Prof. Hans Joachim Eichler, Prof. Gernot Renger Prof. Andreas Knorr, Prof. Thomas Renger Monika Weß, Christof Theiss, Zdenek Petrášek, Ronald Steffen Marco Vitali, Christian Cardenas Chavez, Marten Richter Chris Scharfenorth, Peter Richter und an alle Mitarbeiter des Optischen Instituts und Max Volmer Laboratorium, die mich unterstützt haben.