Ausdehnung des Nahfeldes nur durch Strukturgrösse limitiert

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1 6.2.2 Streulicht- Nahfeldmikroskop Beleuchtung einer sub-wellenlängen grossen streuenden Struktur (Spitze) Streulicht hat Nahfeld-Komponenten Detektion im Fernfeld Vorteile: Ausdehnung des Nahfeldes nur durch Strukturgrösse limitiert 51

2 Einfachere Realisierung Nachteile: Streuintensität ist proportional vierter Potenz des Volumens des Streuers: Sehr kleine Signale Viel Hintergrund 6.3 Experimentelle Aspekte Spitzen Ziehen von Glasfasern 52

3 Chemisches Ätzen AFM-Cantilever 53

4 Anschliessende Bedampfung mit Aluminium Schärfen der Spitze mit Ionenstrahlen Regelung des Sondenabstands Ähnlich AFM verschiedene Möglichkeiten: Kontaktmodus: Probe muss robust sein Senkrechte oder horizontale Anregung von resonanten Oszillationen der Spitze, abstandsabhängige Dämpfung wird detektiert (Amplitude und/oder Phase) Zusammenfassung Mikroskopie Konventionell Konfokal 4π 2 Photon STED Nahfeld Auflösung λ 2N.A. λ 3N.A. λ 3N.A. λ 3N.A. 0 0 z-auflösung 3 λ 2 N.A. λ N.A. 1 λ 3 N.A. λ N.A. 0 keine Geschwindigkeit schnell langsam langsam langsam langsam langsam Aufwand gering mittel sehr hoch mittel sehr hoch sehr hoch 54

5 7 Einzelmoleküldetektion und -spektroskopie 7.1 Ziel Aufspüren von Heterogenitäten statisch: Molekül A ist anders als Molekül B dynamisch: Molekül ist zum Zeitpunkt t 1 anders als zum Zeitpunkt t Voraussetzungen Zwei Voraussetzungen entscheidend Fluoreszenzsignal soll nur von einem Molekül kommen: Adressierung Fluoreszenzsignal muss grösser als Rauschen sein: Signal / Hintergrund Adressierung Bei Temperaturen nahe absolutem Nullpunkt: spektrale Adressierung möglich Bei Raumtemperatur: Optische Adressierung einzelner Moleküle mittels Mikroskopie Abstand grösser als Auflösung: möglichst hohe Auflösung, niedrige Konzentration 55

6 7.2.2 Signal / Hintergrund Photophysik und Emissionsrate Ratengleichungen für die relativen Populationen n 1... n 3 in den Zuständen im Dreiniveaux-System ohne stimulierte Emission: n 1 = k 12 n 1 + k 21 n 2 + k 31 n 3 n 2 = +k 12 n 1 (k 21 + k 23 )n 2 n 3 = k 23 n 2 k 31 n 3 E k12 n2 k21 k23 k31 n3 n1 Zusätzliche Bedingung: n 1 + n 2 + n 3 =1(System ist in einem der drei Zustände) stationäre Lösung (alle Ableitungen verschwinden) liefert Emissionsrate R fl = k 21 n 2 : R fl = k 21 k 12 k 12 (1+ k23 k 31 ) + k 21 + k 23 Anregungsrate ist Proportional zu Laserintensität I L : k 12 I L Sättigung: Fluoreszenzintensität ist begrenzt, kann nicht beliebig gesteigert werden Emissionsrate bei sehr starker Anregung (k 12 ): R = k 21 k 23 k

7 Emissionsrate als Funktion der Anregungsintensität I L R(I L )=R I sat + I L Quellen für Hintergrund Dunkelsignal: Detektor liefert Signal auch ohne Lichteinfall, konstant Streulicht, Hintergrundfluoreszenz: Laserlicht wird gestreut, regt Fluoreszenz an, die nicht vom untersuchten Molekül stammt Signal-to-Noise Ratio (SNR) SNR = η det R T int η det R = T int ηdet R T int + C b I L T int + N d T int ηdet R + C b I L + N d 57

8 Singnal ist unabhängig von Beleuchtungsvolumen Hintergrund ist Proportional zu Beleuchtungsvolumen also: Beleuchtungsvolumen möglichst klein 7.3 Techniken Mikroskopietechniken Konfokal Total internal reflection 58

9 Epifluoreszenz Nahfeld Detektion in Lösung Detektionsvolumen örtlich fest in Lösung 59

10 Diffusion der Moleküle führt zu zufälligen Durchgängen durch das Detektionsvolumen Integration der Fluoreszenzeigenschaften über die Transitzeit Histogramm (Häufigkeitsverteilung) über die Eigenschaft Korrelationsanalyse (siehe 8) Detektion immobilisiert Moleküle räumlich fixiert: an Oberfläche gebunden in Vesikeln gefangen im Gel eingebettet elektrische Falle Abbildung zum Auffinden der Molekülposition 60

11 Detektionsvolumen auf Molekül positioniert: Messung der Fluoreszenzeigenschaften als Funktion der Zeit 7.4 Methoden und Anwendungen Intensität Messung der Fluoreszenzintensität als Funktion der Zeit Anwendung 61

12 Enzymkinetik Positionsbestimmung Position lässt sich theoretisch beliebig genau bestimmen 62

13 praktische Genauigkeit etwa 1 nm Bewegung von Molekülen kann verfolgt werden Positionsbestimmung zweier Moleküle getrennt: räumliche Information Anwendungen Molekulare Motoren 63

14 Abstandsmessung Spektral unterscheidbare oder zufällig hell/dunkel werdende Farbstoffe 64

15 7.4.3 Orientierung Polarisation Detektion mit polarisierendem Strahlteiler Rotation eines Polarisators in der Anregung Rotation eines Analysators in der Detektion Anwendungen F0F1 ATPase spfret Anwendung von FRET (siehe 2.1) auf einzelne Paare Intermolekular: Donor und Akzeptor an einem Molekül Konformationsänderungen Intramolekular: Donor und Akzeptor an verschiedenen Molekülen Wechselwirkungen 8 FCS ganz allgemein: Analyse der zeitabhängigen Intensität mittels Autokorrelationsfunktion im engeren Sinn: Analyse der Fluktuationen von in Lösung diffundierenden Molekülen 65