Einzelmolekülstudien

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1 Einzelmolekülstudien

2 Motivation Ensemble-Messung: - Bestimmung eines Mittelwertes des Ensembles (z.b. gemittelte Struktur von Proteinmolekülen in einem Proteinkristall) - gute Statistik: verlässlicher Mittelwert Einzelmolekülmessung: - Bestimmung eines Messwertes der die Eigenschaft eines individuellen Moleküls widerspiegelt - Mehrfachmessung geben weitere Information Neue Anwendungen statische Messungen - Anwendung auf heterogene Proben, - Bestimmung von Subpopulationen,Verteilungen zeitaufgelöste Messungen - in Proben ohne Synchronisation oder mehr Information bei schlechter Synchronisation - Beispiele: Motorproteine, Proteinfaltung, etc.

3 SM in der Zelle

4 SM - Techniken Optical Tweezers Patch Clamp Fluorescence Atomic Force Microscopy (AFM)

5 Optical Tweezer - Prinzip Zwei Kräfte: - Gradientenkraft (Brechung) - Streukraft Erlaubt Manipulation und Kraftmessung im pn-bereich

6 Konfokales Mikroskop SM-Fluoreszenz Techniken Die konfokale Mikroskopie verbindet eine hohe Auflösung senkrecht zur optischen Achse (x-y-ebene) mit einer vergleichbaren Auflösung in z-richtung. Excitation Es ist durch Excitation die folgenden Eigenschaften charakterisiert:! extrem kleine Tiefenschärfe! Die Lochblende B 2 lässt nur Licht von einer Nearfield sehr begrenzten Schichtdicke (z = z 0 ) passieren. Evanescent field! Licht aus anderen Bereichen z! z 0 kann die Blende nicht passieren (=> effektive Streulicht Unterdrückung)! Durch Verschiebung des Objekts in z-richtung können die Schichten nacheinander isoliert voneinander abgebildet werden. Fluorescence Fluorescence Prinzip eines konfokalen Mikroskops Konfokal Scanning Innere Totalreflektion Biospektroskopie 189 Imaging Nahfeld Scanning

7 Konfokalmikroskopie Bildebene Bildebene Objektebene Bildebene Lichtquelle Lichtquelle Lichtquelle Konventionelles Mikroskop Transmissions- Konfokalmikroskop Reflexions- Konfokalmikroskop

8 Anwendung: Motorproteine Myosin Kinesin Dynein Aktinfilament Mikrotubuli Weitere Motorproteine: ATPasen Polymerasen Helikasen gerichtete Translokation entlang eines Transportweges (Filamente) Umwandlung chemischer Energie (ATP- Hydrolyse) in mechanische Energie Geschwindigkeiten: ~ µms -1 Kräfte: einige Pikonewton Aufgaben in der Zelle: z.b. Muskelkontraktion, Transport (Vesikel, Organellen) Zellbewegung, Spindel (Zellteilung)

9 Myosin Polarität Muskelkontraktion 1 µm

10 Kinesin Mikrotubulus + Ende Vesikeltransport Ende

11 Hand-over-Hand Modell Kinesin

12 Beobachtung mit Tweezer + Fl. Motor auf Deckglas immobilisiert Aktinfilament mit Beads an den Enden ATP-Bindung mit fluoreszenzmarkiertem ATP verfolgt Ishijima et al. Cell, 1998

13 Beobachtung mit Fluoreszenz Hand-Over-Hand: Verschieden weite Schritte Inchworm: Gleich weite Schritte Auflösung: 230 nm, Positioniergenauigkeit: 2 nm

14 Motor: F 0 F 1 ATPase

15 Fluoreszenz - Videomikroskopie

16 Polarisationsaufgelöste Detektion Polarisierender Strahlteiler

17 Rotation bei der ATP Hydrolyse

18 Einzelmolekül - FRET Donor Fluorescein Akzeptor Rhodamin Energieüberlapp Hovius et al., TIBS, 2000 Biospektroskopie

19 Anwendungen spfret Proteinfaltung Konformationsänderung Protein-Protein/Substrat Wechselwirkung

20 Anwendung auf Proteinfaltung Schuler et al., Nature 419, (17 October 2002); doi: /nature01060

21 Anwendung auf Proteinfaltung Zeitspuren Effizienz - Histogramme (Pro) 6 (Pro) 20 CspTm

22 Anwendung auf Proteinfaltung (Pro) 20 CspTm