Optische Pinzetten: die Kräfte des Lichts. Prof. Dr. Holger Kress Experimentalphysik I Biologische Physik

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1 Optische Pinzetten: die Kräfte des Lichts Prof. Dr. Holger Kress Experimentalphysik I Biologische Physik 40. Fortbildungsveranstaltung für Physiklehrer/innen 1. Oktober 2015

2 Was sind optische Pinzetten und wie funktionieren Sie?

3 Grundlagen und Funktionsweise optischer Pinzetten

4 Photonenimpuls Photon besitzt einen Impuls Impuls eines sichtbaren Photons Spiegel Zum Vergleich: Impuls eines PKW auf Autobahn = mal mehr als Photon! Photon Impuls p Impuls nach Reflexion p Impulsübertrag auf Spiegel Δp

5 Optische Kraft durch Impulsübertrag Kraft auf Leinwand: Impulsänderung pro Zeit Laserpointer mit 1 mw Leistung Kraft auf Leinwand

6 Optische Kräfte in fokussiertem Licht 1986: Entwicklung der ersten optischen Pinzette durch Arthur Ashkin und Steven Chu

7 Frei diffundierende Partikel Partikel mit 1µm und 350 nm Durchmesser

8 Partikel in optischer Pinzette

9 Charakterisierung und Kalibrierung optischer Pinzetten

10 Kalibrierung einer optischen Pinzette mit Videomikroskopie

11 Kalibrierung einer optischen Pinzette mit Interferometrie Datenaufnahmerate mit Photodioden (QPD) > 1 MHz möglich Problem: Relation zwischen QPD-Signal (in Volt) und Partikelposition im Allgemeinen unbekannt. Lösung: Anwendung von statistischer Physik

12 Kalibrierung mit Interferometrie und Langevin-Methode Positionsignal-Histogram Harmonisches Potential: Positionssignal Fluktuationsbreite Kalibrationsfaktor Autokorrelation Fluktuationsbreite Harmonisches Potential: Korrelationszeit Kraftkonstante Äquipartitionstheorem

13 Vergleich zwischen Theorie und Experiment

14 Kräfte in optischen Pinzetten: Theorie und Experiment Theorie Experiment & Theorie Fourieroptik Hochfokussierte polarisierte Felder Mie-Theorie Lichtstreuung in fokussierten Feldern Optische Kräfte für Partikel mit d λ Rohrbach, PRL (2005) Gradientenkraft Streukraft

15 Interferometrische Partikeldetektion: Theorie und Experiment Theorie Experiment & Theorie Fourieroptik Hochfokussierte polarisierte Felder Mie-Theorie Lichtstreuung in fokussierten Feldern Detektionsbereich für Partikel mit d λ Axial detection range (μm) Experiment Calculation Kress et al. Phys. Rev. E (2005)

16 Wozu kann man optische Pinzetten verwenden?

17 Aufbau einer Zelle Alberts et. Al, Essential Cell Biology (2010)

18 Elementare Zellbestandteile: Proteine Ein wichtiger Bestandteil unserer Nahrung Moleküle, die u. a. biochemische Reaktionen katalysieren (Enzyme) Molekulare Maschinen Harvard University/XVIVO

19 Anwendung in Einzelmoleküluntersuchungen an Proteinen

20 Molekulare Motoren sorgen für Transport in Zellen Kinesin Motor und Mikrotubulus Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)

21 Transportvorgänge in Nervenzellen Modifiziert von Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)

22 Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Geschwindigkeit Gemessene Geschwindigkeiten molekularer Motoren: Kinesin: 1-2 µm/s Myosin V: µm/s Alberts et al., Essential Cell Biology, 2010

23 Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Schrittweiten Schemazeichnung eines Aufbaus zur Messung der Schrittweiten eines molekularen Motors Experimenteller Aufbau für interferometrisches Particle Tracking Svoboda et. al, Nature (1993) Rohrbach et. al, Rev. Sci. Instrum. (2003)

24 Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Schrittweiten Direkte Schrittmessung Funktion der Paarweisen Distanzverteilung Svoboda et. al, Nature (1993) Ergebnis: Kinesin hat Schrittweite von 8 nm!

25 Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Schrittweiten Schrittweite 8 nm Alberts et. al, Essential Cell Biology (2010)

26 Physikalische Charakterisierung von Motor-Proteinen: Kraft Messung der Kraft eines einzelnen Kinesin-Motors mit einer optischen Pinzette Joshua Shaevitz, Stanford University Steve Block Labor, Stanford University Maximalkraft von Kinesin-Motoren: 5-8 pn (also N)

27 RNA-Polymerase: Ein molekulare Motor für die Transkription von DNA Abstand zweier Basenpaare: 3.4 Å Schrittweite 8 nm Abbodanzieri et. al, Nature (2005)

28 RNA-Polymerase: Ein molekulare Motor mit einer Schrittweite von 3.7 ± 0.6 Å Schrittweite 8 nm Abbodanzieri et. al, Nature (2005)

29 Untersuchungen an einzelnen Zellen: Mechanik von Filopodien

30 Filopodien agieren als Fangarme in Fresszellen Retraktion von Filopodien Kress et al., PNAS (2007)

31 Diskrete Schritte in linearer Retraktion Schrittweitenhistogram Aktinfilamente sind notwendig für Retraktion Aktinfilament-basierter Kraftgenerator mit Schrittweite von 36 nm Kress et al., PNAS (2007)

32 Kraft-Geschwindigkeits-Relation der Retraktion Verfügbare freie Energie pro Motorschritt: Maximale Kraft eines einzelnen Motors: fit parameter: d = 4.6 ± 0.4 nm Kress et al., PNAS (2007) Thermodynamisches Modell für mehrere molekulare Motoren: Kraft-abhängige Einzelmotor-Kinetik wird durch erweitertes Einzustandsmodell beschrieben Mehrere Motoren teilen sich die Zugkraft gleichmäßig auf

33 Einschub zu holographischen optischen Pinzetten

34 Von Einzelstrahlpinzetten zu Mehrstrahlpinzetten 1µm Silicapartikel Mehrere Fallen 1µm Silicapartikel Objektiv Phasenmaske Hologramm Chapin et al. (2006) Dufresne, et al (1998, 2001) Laser 1998: Entwickliung der ersten holographischen optischen Pinzetten durch David Grier und Eric Dufresne

35 Holographische optische Pinzetten Aktueller Aufbau an der Uni Bayreuth (Konrad Berghoff, Steve Keller, Adal Sabri, Wolfgang Groß und Lisa Gebhardt)

36 Untersuchung einzelner Zellen: Raum-zeitlich flexible chemische Stimulierung

37 Kontrolle über die chemische Mikroumgebung von einzelnen Zellen Immunzelle (Neutrophile) und Bakterium Hypothese: Kurzreichweitiger positiver und langreichweitiger negativer Rückkopplungskreis By David Rogers (Vanderbilt University) 1950s, 16 mm camera Weiner, Curr. Opin. Cell. Biol Welches sind die charakteristischen Längen- und Zeitskalen? Flexible raum-zeitliche Zellstimulierung nötig!

38 Flexible Zellstimulierung mit optisch gefangenene Mikroquellen

39 Mikroquellen: Struktur und Wirkstoff-Abgabeverhalten Material: PLGA (Polymer) Kontrollierte Wirkstoffabgabe eingeschlossener Chemikalien (Lockstoff fmlp) bead concentration: 1 mg/ml Konzentrationsprofil um einzelnes Mikropartikel Kress et al., Nature Methods (2009) Gradient auf der Längenskala einer Zelle:

40 Zellreaktionen auf flexible partikel-basierte Stimulierung Ein anziehendes Partikel (welches den Lockstoff fmlp absondert) Zwei repulsive Partikel (welche den Aktin-Inhibitor Cytochalasin absondern) Kress et al., Nature Methods (2009)

41 Untersuchung einzelner Zellen: Zelluläre Entscheidungsfindung

42 Zelluläre Entscheidungsfindung Aktuelles M.Sc. Projekt von Adal Sabri mit Unterstützung durch Konrad Berghoff, Steve Keller und Kathrin Weidner-Hertrampf

43 Phagozytose: Einverleibung von Partikeln Monica Hagedorn, 2005 Mayer-Scholl et al., PLoS Pathogens 2005

44 Aufnahme von zwei Partikeln: Getrennt oder gemeinsam? Getrennte Internalisierung zweier Partikel Gemeinsame Internalisierung zweier Partikel

45 Getrennte Aufnahme von zwei Partikeln

46 Gemeinsame Aufnahme von zwei Partikeln

47 Entscheidungsverhalten der Zelle hängt vom Partikelabstand ab Partikel = 2 µm

48 was kann man noch so alles mit optischen Pinzetten machen? Vrije Universiteit Amsterdam

49 Danksagung Doktoranden Konrad Berghoff Wolfgang Groß Steve Keller Herbst 2014 Master StudentInnen Tim Klaußner Silvie Krizova Adal Sabri Christina Zahn Steve Konrad Lisa Adal Wolfgang Philipp Tim Christina Andrea Margot Holger Kathrin Bachelor Studenten Stefan Conrad Christopher Greve Veit Mengling TechnikerInnen Pamela Anger Andrea Hanold Ralf Pihan Kathrin Weidner- Hertrampf Alumni Philipp Dorscht Manuel Eisentraut Lisa Gebhardt Michael Schukalski

50 Literatur: Erste Beschreibung einer optischen Pinzette

51 Literatur: Erste Beschreibung einer holographischen optischen Pinzette

52 Literatur: Übersichtsartikel (Reviews) zu optischen Pinzetten

53 Literatur: Praktische Anleitungen zu optischen Pinzetten

54 Zusammenfassung Grundlagen und Funktionsweise optischer Pinzetten Charakterisierung und Kalibrierung optischer Pinzetten Vergleich zwischen Theorie und Experiment Einzelmoleküluntersuchungen an Proteinen Kinesin-Motor RNA-Polymerase Untersuchungen an einzelnen Zellen Mechanik von Filopodien Einschub zu holographischen optischen Pinzetten Raum-zeitlich flexible chemische Stimulierung von Zellen Zelluläre Entscheidungsfindung Literaturempfehlungen