Modul biol113 Zellbiologie - Nachweis von mitochondrialem Import

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1 Modul biol113 Zellbiologie - Nachweis von mitochondrialem Import Einführung Ein grundlegendes Problem der Zellbiologie ist es, die korrekte zelluläre Lokalisation eines Peptides zu bestimmen. Durch den komplexen und kompartimentierten Aufbau einer eukaryotischen Zelle ergeben sich vielfältige Lokalisationsmöglichkeiten. Die korrekte Zuweisung der Peptide zu den Kompartimenten erfolgt dabei in der Regel mittels sogenannter Signalsequenzen (vergl. Abb. 1). Diese Signalsequenzen wurden durch grundlegende Arbeiten des deutschstämmigen US-Amerikaners Günter Blobel entdeckt, der dafür 1999 den Nobelpreis für Medizin erhielt. Im Jahr 1971 formulierte er eine erste Version der sogenannten Signalhypothese, in der er sagte, dass Proteine, die aus der Zelle ausgeschieden werden sollen, ein eingebautes Signal enthalten, das sie zu und durch die Membrane dirigiert. In eleganten biochemischen Versuchen zeigte G. Blobel im Jahr 1975 die verschiedenen Schritte dieses Prozesses auf. Dann konnte Günter Blobel in Zusammenarbeit mit anderen Forschergruppen bald beweisen, dass ähnliche eingebaute Signale den Transport von Proteinen auch zu anderen Organellen steuern. Auf Grund seiner Arbeiten formulierte Günter Blobel im Jahr 1980 ein generelle Prinzip, demzufolge Proteine eingebaute sogenannte topogene Signale enthalten, die die Proteine an den richtigen Platz in der Zelle steuern und auch dafür Sorge tragen, dass sie auf die richtige Art und Weise in die verschiedenen Membranen eingebaut werden. Abb. 1: Verteilung von Peptiden in der eukaryotischen Zelle F. Kempken 2007/08 1

2 Aufgaben 1. Im Rahmen der zellbiologischen Übungen sollen fünf Peptidsequenzen mit Hilfe von im Internet verfügbaren Programmen auf die Existenz von mitochondrialen Signalsequenzen hin untersucht werden. 2. An einem Beispiel soll ein Vektorkonstrukt modelliert werden, das eine Fusion der DNA- Sequenz eines Peptides mit der GFP-Sequenz trägt. 3. Die Ergebnisse von fünf Transformanten, die verschiedene Peptid-GFP-Konstrukte tragen sollen analysiert werden. Dazu sind fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen auszuwerten. 4. Die Ergebnisse zweier in vitro Import Experimente ist auszuwerten. 5. Auf der Basis der einzelnen Experimente ist die zelluläre Lokalisation aller untersuchten Peptide festzustellen. Den Studierenden wird empfohlen einen USB-Stick mitzubringen, um die vorgegebenen und erarbeiteten Daten speichern und protokollieren zu können. Ziele des Versuchs Die Studierenden beherrschen die grundsätzliche Methodik zur Identifizierung der zellulären Lokalisation von Polypeptiden. Sie können GFP-Vektorkonstruktionen in silicio planen. Die Studierenden sind in der Lage Experimente zur zellulären Lokalisation von Peptiden korrekt auszuwerten und Fehlerquellen zu erkennen. Hilfsmittel CLONE MANAGER - ein Programm zur Modellierung von Vektoren PSORT - eine Internetseite zur Analyse der zellulären Lokalisation von Peptiden (PSORTI oder PSORTII benutzen!) DNA / Peptid-Sequenzen / Fotos Fünf Peptidsequenzen befinden sich in dem Ordner ZB-KEM im Unterverzeichnis Peptide. Drei Vektorsequenzen befinden sich im Unterverzeichnis Plasmide. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen sind im Unterverzeichnis Mikroskopie gespeichert. Die in vitro Import Ergebnisse enthält der Order in_vitro. Durch die Vorgabe der Bilder wird es möglich, dass jeder Student selbst Fluoreszenzaufnahmen auswerten kann, obwohl entsprechende Mikroskope in der erforderlichen Zahl nicht zur Verfügung stehen. F. Kempken 2007/08 2

3 Abb. 2: Internetseite PSORT Hinweise zur Durchführung A) PSORT-Analyse 1. Öffnen Sie die Internetseite des PSORT-Programms. Wählen Sie die für die Herkunft der Peptidsequenzen richtige Analyse aus. Tragen Sie Ihre Ergebnisse in Tabelle 1 ein. Tabelle 1: Peptide und PSORT Nr. Peptide Accession No. Organismus PSORT-Ergebnis 1 P29390 Zea mays 2 AJ Physcomitrella patens 3 CAC81058 Arabidopsis thaliana 4 NCBEM Neurospora crassa 5 NP Arabidopsis thaliana F. Kempken 2007/08 3

4 B) in silicio-vektorkonstruktion 2. Als nächstes soll exemplarisch eine GFP-Fusion erstellt werden, um die zelluläre Lokalisation des Peptides CAC81058 zu bestimmen. 3. Im Rahmen der Übung wird dieser Vorgang aus Zeitgründen vereinfacht. Sie erhalten zwei Plasmide, von denen eines die kodierende DNA-Sequenz für das Peptid Nr. 3 enthält (Plasmid pcac81058) und das andere die GFP-DNA-Sequenz (Plasmid pgfp). 4. Nutzen Sie das Programm CLONE MANAGER und erstellen Sie unter Verwendung des binären Basisvektors peap1 ein neues Plasmid, bei dem die Leserahmen der DNA- Sequenz von CAC81058 und der GFP DNA-Sequenz fusioniert sind. 5. Dazu starten Sie das Programm und öffnen die drei Plasmidsequenzen, die sich in dem Ordner ZB-KEM im Unterverzeichnis Plasmide befinden. 6. Schauen Sie sich den Vektor peap1 genau an. Identifizieren Sie den Promotor und den Terminator. Welche Schnittstellen sind für die Insertion von CAC81058 und GFP- Sequenz geeignet? geeignete Schnittstellen: 7. Schneiden Sie den Vektor peap1 mit den ausgewählten Restriktionsenzymen. Dazu wählen Sie unter CLONE die Option CUT und geben die Namen der gewünschten Restriktionsenzyme getrennt von einem Komma ein. Bestätigen Sie mit OK. 8. Wählen Sie jetzt das für die Ligation gewünschte DNA-Fragment aus, drücken Sie CREATE und geben Sie dem Fragment einen eindeutigen Namen. Dieses Zwischenprodukt können Sie für Ihre Dokumentation auch abspeichern. 9. Verfahren Sie genauso analog für die Plasmide pcac81058 und pgfp. 10. Wenn Sie alle drei linearen DNA-Fragmente erstellt haben klicken Sie das CAC81058 Fragment an und wählen Sie unter CLONE die Option Ligate. 11. Fügen Sie in dem neuen Fenster das GFP-Fragmente hinzu. Dies bewerkstelligen Sie mit dem DNA-Molekül-Symbol am rechten Rand des Fensters. 12. Nachdem beide Moleküle erfasst sind drücken Sie Partial und wählen die korrekte Option aus. Sie erhalten ein lineares Fragment, das Sie mit CAC-GFP bezeichnen können. 13. Wählen Sie erneut unter CLONE die Option Ligate und wählen Sie diesmal den geschnittenen peap1 Vektor und das CAC-GFP aus. Diesmal wählen Sie die Option Ligate aus und führen die Ligation aus. 14. Geben Sie dem Produkt einen Namen. Verwenden Sie dazu Ihre Initialen. 15. Hervorragend, Sie haben erfolgreich ein Plasmid konstruiert. Vergessen Sie das Abspeichern nicht! Hinweis: Normalerweise würden Sie nun die tatsächliche Klonierung nach dem Klonierungsplan durchführen und das fertige Plasmid dann in Pflanzenzellen transformieren. Dieser Vorgang nimmt aber etliche Wochen in Anspruch und kann daher im Rahmen des Praktikums nicht durchgeführt werden. F. Kempken 2007/08 4

5 C) Analyse von Fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen 16. Schauen Sie sich die fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen an, die Sie im Ordner ZB- Kem im Unterverzeichnis Mikroskopie finden. 17. Die Aufnahmen stammen von transgenen Organismen, in die Vektoren mit Peptid-GFP- Konstrukten transformiert wurden. Zum Teil liegen auch Aufnahmen von Kontrollexperimenten vor, die bei der Auswertung zu berücksichtigen sind. Tabelle 2: Liste der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahmen Nr. Peptid Bezeichnung Auswertung der Aufnahme 1 P29390 P2939.pdf 2 AJ AJ416.pdf 3 CAC81058 CAC81.pdf 4 NCBEM NCBEM.pdf 5 NP NP565.pdf D) in vitro Import Experimente 18. In der Datei in vitro Import.pdf sind für Peptid CAC81058 und P29390 jeweils in vitro Importexperimente gezeigt. Diese Experimente sind auszuwerten. Geben Sie jeweils an ob ein mitochondrialer Import vorliegt und begründen Sie dies. Peptid Nr. CAC81058: Peptid Nr. AJ416854: F. Kempken 2007/08 5

6 E) Vergleich der Ergebnisse von A, C & D Nr. Peptide PSORT- Fluoreszenz- in vitro Import Endergebnis Accession No. Ergebnis mikroskopie 1 P AJ CAC NCBEM 5 NP Literatur Hörmann F, Soll J, Bölter B (2007) The chloroplast protein import machinery: a review. Methods Mol Biol. 390: Mathur J (2007) The illuminated plant cell. Trends Plant Sci 12: Neupert W, Herrmann JM (2007) Translocation of proteins into mitochondria. Annu Rev Biochem.76: Pemberton LF, Blobel G, Rosenblum JS (1998) Transport routes through the nuclear pore complex. Curr Opin Cell Biol. 10: Raum für Notizen - F. Kempken 2007/08 6