Konfokale Mikroskopie

Transkript

1 Konfokale Mikroskopie Seminar Laserphysik SoSe 2007 Christine Derks Universität Osnabrück

2 Gliederung 1 Einleitung 2 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop 3 Auflösungsvermögen 4 andere Konfokale Mikroskope 5 Zusammenfassung 2

3 1 Einleitung Entwickelt 1955 von Marvin Minsky * 9.August Bachelor in Mathematik in Harvard 1954 Doktor der Mathematik in Princeton Seit 1958 Mitglied im MIT (Massachusetts Institute of Technology) 3

4 Lichtmikroskop Das Objekt wird durch Objektiv und Okular optisch abgebildet. 1. Das Objektiv erzeugt ein echtes Zwischenbild vom Objekt. 2. Dieses Zwischenbild wird durch das Okular betrachtet. 4

5 Lichtmikroskop Problem: Fokusebene wird scharf abgebildet, aber von anderen Ebenen überlagert, die unscharf abgebildet werden. Dicke der Probe darf Schärfentiefe des Mikroskops nicht übersteigen. 5

6 Lichtmikroskop Lösung: Einführen einer konfokalen Blende konfokales Prinzip 6

7 Konfokale Mikroskope Drei hauptsächlich verwendete Mikroskoparten Konfokales Laser-Rastermikroskop Konfokales Weißlichtmikroskop Nipkow-Mikroskop 7

8 2 Laser-Scanning-Mikroskop Prototyp und erste Seite des Patentantrages 8

9 Laser-Scanning-Mikroskop Laser-Scanning- Mikroskop von Carl Zeiss 9

10 Schematischer Aufbau 10

11 Lichtquelle Laser Argon-Ionen-Laser λ = 514,5nm λ = 488nm ND YAG λ = 532nm HeNe Gaslaser λ = 543nm Diodenlaser λ = 635nm 11

12 Die konfokale Blende Laser wird auf Probe fokussiert Trotzdem Reflexion und Anregung in anderen Teilen Objektiv bildet auch unerwünschte Bildanteile ab. Linse bündelt auf konfokale Blende 12

13 Die konfokale Blende 13

14 Die konfokale Blende Die Größe des Pinholes wird in Airy-Einheiten angegeben. 1AE 1, 22λ = NA λ = λ λ em exc λem + λexc λ em λ exc Emissionswellenlänge Anregungswellenlänge 14

15 Optik Farbeteiler Reflektiert und transmittiert Licht Scannspiegel Lenken den Laser in x-y-richtung über die Probe Linsen Fokussieren den einfallenden Laserstrahl und den reflektierten oder emittierten Laserstrahl 15

16 Signalverarbeitung Durch Nachschalten eines Prismas hinter das Pinhole kann das Signal wellenlängenabhängig verarbeitet (detektiert) werden. Zur Detektion wird ein Photomultiplier verwendet. 16

17 Optische Schnitte Das CLSM ermöglicht das Erzeugen optischer Schnitte. Der Objekttisch wird in z- Richtung bewegt. Dies ermöglicht Schnitte in alle 3 Raumrichtungen. 17

18 Reflexionsmodus Laserstrahl wird reflektiert Wellenlänge des einfallenden Strahls ist identisch mit Wellenlänge des reflektierten Strahls Passender Strahlteiler, beispielsweise 30% Reflexion / 70% Transmission 18

19 Reflexionsmodus Beispiel Mikroskopie eines Sterns einer 2 Cent Münze 19

20 Reflexionsmodus Beispiel Die fokussierte Ebene ist deutlich heller als die höher bzw. tiefer liegenden Ebenen. 20

21 Reflexionsmodus/optischer Schnitt 21

22 Fluoreszenzmodus Einfallender Laserstrahl regt Fluoreszenz an Wellenlänge des einfallenden Strahls ist kleiner als Wellenlänge des ausfallenden Strahls, der durch Fluoreszenz entsteht. 22

23 Fluoreszenzmodus Beispiel Farbteiler soll anregenden Strahl transmittieren und Fluoreszenzlicht reflektieren. 23

24 24

25 25

26 Fluoreszenzmodus Beispiel 26

27 3 Auflösungsvermögen Ein Punkt kann nicht wieder auf einen Punkt abgebildet werden. Verwaschungen Man erhält einen Rotationselipsoiden im Kern mit schwächeren Strukturen darum herum. 27

28 Auflösungsvermögen Beschreibung durch Point Scattering Funktion PSF Zur Berechnung des Auflösungsvermögens wird die Halbwertsfläche der PSF verwendet. Ungenauigkeit PSF Ges kommt durch PSF Bel und PSF Nachw zustande. 28

29 Auflösungsvermögen/ geometrisch optische Konfokalität Durchmesser des Pinholes > 1AE Punkte sind getrennt auflösbar, wenn ihr Abstand größer als die PSF Bel ist. 29

30 Auflösungsvermögen/ wellenoptische Konfokalität Durchmesser des Pinholes < 1AE 30

31 Auflösungsvermögen Geometrisch optische Konfokalität Wellenoptische Konfokalität Laterales Auflösungsvermögen Axiales Auflösungsvermögen Optische Schnittdicke 0,51 λ em 0,37 λ NA NA 0,88 λ exc n n NA ,64 λ n n NA 2 2 0,64 λ 0,88 λ em 2 n PH n n NA NA 2 2 n n NA 31

32 4 Konfokale Mikroskope Drei Haupttypen Konfokales Laser-Rastermikroskop Wichtigste Umsetzung Konfokales Weißlichtmikroskop Ermöglicht Farbabbildungen Nipkow-Mikroskop Enthält zusätzlich Nipkow-Scheibe, dadurch entfällt laterales scannen der Probe 32

33 Konfokales Weißlichtmikroskop Unterschied: weißes Licht, anstelle eines Lasers Farbabbildungen möglich Nachteil: Geringe Intensität Längere Beobachtungszeiten Verbesserung: mehrere parallele Strahlengänge, die eine gleichzeitige Beobachtung mehrerer Stellen auf dem Objekt ermöglichen 33

34 Nipkow-Mikroskop Konfokale Mikroskope mit Nipkow-Scheiben produzieren mehrere hundert Bilder pro Sekunde, so dass für das Auge ein konstantes Bild entsteht. 34

35 Anwendungsgebiete Biologie und Medizin Fluoreszenzmikroskopische Aufgabenstellung Materialkunde Industrielle Qualitätssicherung 35

36 5 Zusammenfassung Konfokale Mikroskopie ist die Verbesserung der Lichtmikroskopie durch den Einsatz einer konfokalen Blende. 36

37 Quellen df Gerthsen Physik (Springer Lehrbuch) von Dieter Meschede und Christian Gerthsen 37

38 Vielen Dank für ihre Aufmerksamkeit