Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen. Paul Käufl

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1 Enzym-Dynamik an einzelnen Molekülen Paul Käufl

2 Enzym-Dynamik einzelner Moleküle Quelle: (5) 2

3 Enzym-Dynamik einzelner Moleküle Bis vor ca. 20 Jahren: Chemische Reaktionen (in Lösung) im Wesentlichen nur im Ensemble untersucht Messung von Konzentrationen der Ausgangs(u.U. Zwischen-) und Endprodukte Einzelne Molekülparameter konnten kaum untersucht werden 3

4 Enzym-Dynamik einzelner Moleküle Neue Verfahren (z.b. Fluoreszenzmikroskopie) erlauben die Beobachtung einzelner Moleküle während der Reaktion in Echtzeit Fluoreszenzbild von COx Quelle: (1) 4

5 Cholesterol Oxidase (COx) Enzym katalysiert Oxidation von Cholesterol Quelle: (4) 5

6 Cholesterol Oxidase (COx) Ribbon-Diagramm von COx Quelle: (2) 6

7 Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) Quelle: (3b) Koenzym Flavin-AdeninDinukleotid (FAD) im aktiven Zentrum nichtkovalent gebunden 7

8 Flavin Adenin Dinukleotid (FAD) fluoreszierend im oxidierten Zustand Quelle: (1) 8

9 Experiment: COx in Aktion Gewinnung von COx aus Bakterium (Brevibacterium sp.) kleine Anzahl COx Moleküle (33) in Agarose Gel (99% Wasser) Cholesterol (0,2 mm) / O2 (0,25 mm gesättigt) 9

10 Experiment: COx in Aktion Pufferlösung: Agarose Gel Keine Translation der COx Moleküle, aber: Substrat Moleküle beweglich schnelle Rotation ( >> 20 Hz) verhindert Binden an das Gel Fluoreszenz Mikroskopie Rasterscan der Probe, HeCd-Laser (442 nm) Detektion der Photonenemission / Molekül 10

11 Experiment: Beobachtungen Rasterscan der Probe: jeder Peak = einzelnes COx Molekül Zeitliche Trajektorie eines Moleküls: Blink -Verhalten Rasterscan der Probe Quelle: (1) Quelle: (1) 11

12 Emissionsverhalten eines Moleküls Blink - Zyklus Reaktionszyklus (FAD FADH2) 12

13 Experiment Kontrollexperimente: Ohne Cholesterol kein Blinken Zyklenraten unabhängig von Anregungsintensität mittlere Zyklenraten mittleren Reaktionsraten aus Ensemble-Experimenten (unter gleichen Bedigungen) 13

14 Auswertung des Experiments Lange Trajektorien (> 500 Zyklen, min) ermöglichen statistische Analyse Trajektorien weisen stochastische Eigenschaften auf Verteilung der An- und Aus-Perioden wird statistisch untersucht 14

15 Auswertung des Experiments Aus der Trajektorie ergibt sich ein Histogramm: Verteilung der On-times bei 0.2 mm Cholesterol Quelle: (1) 15

16 Auswertung des Experiments Ein Schritt zurück... Was erwarten wir eigentlich zu sehen? 16

17 Vom Ensemble zum Molekül k [S] Konzentrationsrate: k Zustand: An oder Aus Wahrscheinlichkeit: P [P] P aus an Konzentrationen: [E], [S], [P] Wahrscheinlichkeitsverteilung: p(t) 17

18 Einfachstes Schema kf E FAD E FADH 2 an kb aus d[ FAD] = k f [ FAD] kb [ FADH 2 ] dt d[ FADH 2 ] =k f [ FAD] kb [ FADH 2 ] dt 18

19 Einfachstes Schema [ FAD ] exp k f kb t [ FADH 2 ] exp k f kb t Quelle: (7) 19

20 Einfachstes Schema Wahrscheinlichkeitsverteilung (Poisson-Prozess): kt p on t =c e 20

21 Wahrscheinlichkeitsverteilung... aber es zeigt sich: Quelle: (1) 21

22 Reaktionskinetik Ping-Pong -Mechanismus k1 E FAD S an k 1 k2 E FAD S an k '1 E FADH 2 O 2 aus k' 1 E FADH 2 P aus k '2 E FADH 2 O 2 aus E FAD H 2 O2 an 22

23 Reaktionskinetik Zwei Michaelis-Menten Reaktionen im Wechsel Reduktions-Reaktion FAD an Oxidations-Reaktion FAD Aus Annahme: Weitere Reaktionsschritte sind keine limitierenden Faktoren für die Gesamtreaktion können vernachlässigt werden 23

24 Reaktionskinetik Aus den Reaktionsgleichungen mit Zwischenprodukt erhält man: k1 k2 k t k t p on t = [e e ] k2 k

25 Wahrscheinlichkeitsverteilung pon(t)...was gut zu den gemessenen Daten passt: [S]=0.2 mm k1=2.9 s-1 k2=17 s-1 25

26 Wahrscheinlichkeitsverteilung pon(t) Erhöhung der Cholesterol-Konzentration [S]=2 mm k1=33 s-1 k2=17 s-1 26

27 Ergebnisse der Analyse Erhöhung der Cholesterol-Konzentration mittlere An-Zeiten werden kürzer k1 Cholesterol-Konzentration, k2 bleibt konstant Die Verteilung der Aus-Zustände bleibt unverändert Konsistenz mit Michaelis-Menten 27

28 Michaelis-Menten-Mechanismus pre-steady-state: v0 ~ [S] Sättigung: v = Vmax = const. V max [S] V 0= K m [S] Quelle: (6) 28

29 Unordnung von k2 Bisher: 1 Molekül Jetzt: Vergleich der Reaktionsraten mehrerer Moleküle 29

30 Statische Unordnung Sättigungsfall: k2 soll limitierende Rate werden also: k2 << k1 Verwendung eines langsameren Substrats (5-pregene-3β-20α-diol), mit k2=3,9 s-1 30

31 p(t) im Sättigungsfall [S]=2 mm k2=3.9 s-1 Quelle: (1) 31

32 p(t) im Sättigungsfall sehr praktisch: hier reicht also das reversible Schema aus! kf E FAD E FADH 2 an kb aus 32

33 Reaktionsraten k2 mehrerer Moleküle Mittlere Raten von 33 COx Molekülen starke Streuung 33

34 Statische Unordnung statische Inhomogenität der Moleküle Ursachen: Posttranslationale Modifikationen statische Verformung der Enzym-Moleküle 34

35 Dynamische Unordnung Neben statischen Inhomogenitäten: dynamische Fluktuationen der Raten einzelner Moleküle Ohne Einzelmolekül-Analyse nicht zu entdecken! 35

36 Dynamische Fluktuationen aufeinander folgende Zyklen x, y x m y m=1 m=10 36

37 Dynamische Fluktuationen Ein molekulares Gedächtnis? Quelle: (1) m=1 m=10 37

38 Memory-Effekt Diagonales Merkmal für m=1 p(x,y) p(x)p(y) für m=10 keine Korrelation mehr 38

39 Autokorrelation t 0 t m r m = 2 t t m =t m t Quelle: (1) 39

40 Memory-Effekt k2 fluktuiert auf Zeitskala 1s Quelle: (8) ist vergleichbar mit 1/k2 Memory-Effekt 40

41 Woher kommt diese Fluktuation? Spektrale Analyse ergibt: Emissions-Spektrum fluktuiert auf der gleichen Zeitskala wie k2 Konformative Veränderungen des Proteins um das FAD-Molekül Subzustände des Enzyms 41

42 2-Stufen-Modell Simulation mit diesem Modell liefert tatsächlich ein ähnliches Gedächtnis-Verhalten 42

43 Was wurde also beobachtet? COx-Reaktion folgt im Wesentlichen dem Michaelis-Menten-Schema statische Unordnung der Reaktionsraten bedingt durch die Umgebung Molekül-spezifische dynamische Unordnung erzeugt Memory-Effekt 43

44 Einzelmolekül vs. Ensemble Konzentrationsmessungen im GG für Fließgleichgewicht o. während der Reaktion: Stop-Flow, o.ä. Untersuchungen statischer und dynamischer Fluktuationen, u.u. mit biologischer Funktion im Ensemble nicht sichtbare, molekulare Eigenschaften 44

45 Quellen (1) Lu et al., SCIENCE vol.282, p.1877 (1998) (2) RCSB Protein Data Bank (3) Wikipedia a) b) (4) A. Vrielink, L. F. Lloyd, D. M. Blow, J. Mol. Biol. 219, 533 (1991) (5) (6) D. Nelson, M. Cox, Lehninger Biochemie, Springer-Verlag (2001) (7) Ch. E. Mortimer, U. Müller, Chemie, Das Basiswissen der Chemie (2001) (8) 45