Melanopsin und die innere Uhr

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Greta Winkler
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1 Hintergrund Melanopsin und die innere Uhr Benjamin Schuster-Böcker, Betreuer: Dr. Rita Rosenthal Zirkadianer Rhythmus Praktisch alle höheren Lebewesen folgen einem Aktivitätsrhythmus, der dem Wechsel von Hell und Dunkel, also dem Tageslichtrhythmus angepasst ist. Diese evolutionäre Entwicklung liegt vermutlich weit zurück, da gerade in der frühen Phase des Lebens auf der Erde Schutz vor der ungefilterten UV-Strahlung überlebenswichtig war. Allgemein versteht man unter zirkadianer Rhythmik eine körperimmanente Schwingung, die auch ohne äußeren Anstoß läuft, eine angeborene Periodenlänge besitzt, der Periodenlänge der repräsentierten Umweltgröße nahe kommt und mit dieser synchronisierbar ist. Wenn man die Phasen starker Aktivität gegenüber den Ruhephasen darstellt und gegen die Zeit aufträgt, erhält man ein Aktivitätsdiagramm (Abb. 1). Hier ist ein Schema eines solchen Diagramms dargestellt. Es sind die Einflüsse verschiedener Umgebungen dargestellt: 1. Bei völliger Dunkelheit kann die innere Uhr nicht synchronisiert werden, sie läuft also frei. Gut zu sehen ist hier, dass die innere Abb. 1 Schema eines Phasenauslenkungsdiagramms Periodenlänge der äußeren nicht absolut gleicht. Beim Menschen geht man z.b. von t=25 h aus. Jeden Tag verschiebt sich die Aktivitätsphase also um eine kleine Differenz. 2. Ein periodisch auftretendes Licht ausreichender Stärke synchronisiert den inneren Rhythmus. 3. Bei einer Verschiebung der Lichtperiode folgt der innere Rhythmus dem äußeren. 5. Dauerlicht führt genau wie Dauerdunkelheit zu Phasenverschiebung, allerdings natürlich in entgegengesetzter Richtung und abhängig von der Intensität des Lichts 1

Diese evolutionäre Entwicklung liegt vermutlich weit zurück, da gerade in der frühen Phase des Lebens auf der Erde Schutz vor der ungefilterten UV-Strahlung überlebenswichtig war.

2 6. Ein einzelner starker Lichtpuls von wenigen Minuten Dauer kann zu einer zeitweiligen Phasenauslenkung führen Aufbau der Retina Die Retina besteht aus 3 Zellschichten (Abb. 2): Rezeptorzellen: Stäbchen(Licht allgemein) und Zapfen(Farbe) Bipolare Zellen: Horizontalzellen und amakrine Zellen Ganglienzellen: Bilden afferente Axone zum Gehirn Einfallendes Licht muss die Ganglien- und Bipolaren Zellen durchqueren, bevor es auf die Rezeptorzellen trifft. In den Rezeptorzellen befindet sich das Molekül Rhodopsin, welches Lichtquanten absorbieren und dadurch eine Signalkaskade in Gang setzen kann, die letzlich zu einer Hyperpolarisation der Rezeptorzelle führt. Eine bemerkenswerte Beobachtung, die den unten beschriebenen Forschungen Abb. 2 Aufbau der Retina vorausging, war nun: Bei Mäusen ohne Stäbchen oder Zapfen, also ohne die primären Rezeptoren zur Lichtwahrnehmung, beobachtet man trotzdem eine lichtinduzierte Phasenverschiebung! Durchtrennt man allerdings den Nervus opticus, ist keine Phasenverschiebung mehr möglich. Es muss also noch weitere photosensitive Zellen in der Retina geben. Ergebnisse Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen greifen praktisch nahtlos ineinander: 1. Eine Untergruppe retinaler Ganglienzellen (RGCs) ist lichtsensitiv 2. Diese Untergruppe sendet Axone direkt in den suprachiasmatischen Nucleus (SCN), der den inneren Zeitgeber beheimatet 3. alle diese RGCs enthalten das Molekül Melanopsin 4. Melanopsin ist ein Protein Abb. 3 Skizze der Retina (oben). Axone von retinalen Ganglienzellen, die auf den SCN projizieren (b-gal Färbung, links oben). Vergrößerung (links unten). 2

Ganglien- und Bipolaren Zellen durchqueren, bevor es auf die Rezeptorzellen trifft.

3 der Opsin-Familie, das zuerst in Fröschen als Teil der Lumineszenzwahrnehmung identifiziert wurde. Im Einzelnen Abbildung 4a zeigt den SCN von Ratten, der mit Fluorogold inkubiert wurde. Durch retrograden Transport verteilt sich dieses in den Axonen der Zellen, die auf den SCN projizieren. In Abb. 4c sieht man 3 Punkte, an denen das Fluorogold gehäuft auftritt. Abb. 4b zeigt denselben Gewebeschnitt mit in-situ hybridisierten Melanopsin m-rna. Dieselben 3 Punkte sind verstärkt gelabelt. Zellen, die auf den SCN projizieren, exprimieren also selektiv Melanopsin. Um weiter zu untersuchen, ob Melanopsin und die entsprechenden Zellen ein lichtempfindliches System darstellen, wurde die elektrische Reaktion auf Lichtreize abgeleitet. In Abb. 4g sehen wir die Reaktion einer retrograd markierten, Melanopsin enthaltenden Ganglienzelle auf einen starken Lichtpuls ( ph/s/cm 2, 500 nm). Bei der rot dargestellten Ableitung wurden die Ca 2+ - induzierte synaptische Übertragung (CoCl 2 ) die ionotropen und metabotropen Glutamatrezeptoren und ionotrope GABA und Glycin-Rezeptoren blockiert. Abb. 4 Retrogrades Labeling aus dem SCN, elektrophysiologische Ableitung von RGCs (a, c) retrograde Markierung von Neuronen aus dem SCN durch Fluorogold. (b) Cross- Labeling mit Melanopsin-mRNA. (g) Ableitung von RGCs mit (rot) und ohne (schwarz) Blockade der synaptischen Übertragung nach Lichtreiz. (h) Isolierte Melanopsin enthaltende Ganglienzelle. (i) Ganglienzelle ohne Melanopsin. 3

Dieselben 3 Punkte sind verstärkt gelabelt. Zellen, die auf den SCN projizieren, exprimieren also selektiv Melanopsin.

4 Die Abbildungen zeigen deutlich eine intrinsische Photosensitivität der Melanopsin enthaltenden retinalen Ganglienzellen. Bei genauerer Betrachtung der Wellenlängen stellt man zudem fest, dass die stärkste Reaktion genau bei der Wellenlänge zu beobachten ist, bei der auch Melanopsin in vitro sein Absorptionsmaximum besitzt. Es zeigte sich weiterhin, dass die Melanopsin enthaltenden Ganglienzellen eine andere Morphologie besitzen als nicht photosensitive RGCs. Sie bilden mit langen Dendritenbäumen ein Geflecht auf der Netzhaut, das diese gleichmäßig überdeckt (Abb. 5). Diese Dendritenbäume sind besonders reich an Melanopsin. Auch das deutet auf eine Funktion dieser RGCs als Luminanz- Sensor hin. Eine weitere Serie von Experimenten wurde mit Melanopsin Knock-out Mäusen durchgeführt. Diese zeigten bei normalem Tageslichtwechsel eine normale Phasenanpassung, sie hatten in etwa die gleiche Periodenlänge wie Wildtyp-Mäuse und auch ihre Phasenverschiebung bei Freilauf in Dauerdunkelheit entsprach der normaler Tiere (Knock-out (KO) Wildtyp (WT)). Unterschiede zeigen sich vor allem bei Phasenauslenkung durch schwache Lichtquellen, im Experiment zu Abb. 6 monochromatisches Licht von ca. 480nm bei 3 verschiedenen Beleuchtungsstärken (6c). Man sieht deutlich, dass die Phasenverschiebung Abb. 6 Immunostaining von RGCs aus der Retina Abb. 5 Verhaltensexperimente mit Melanopsin Knock-Out Mäusen (c) Phasenverschiebung nach kurzem Lichtpuls unterschiedlicher Strahlungsstärke bei KO und Wildtyp Mäusen. (d)periodendauer bei Freilauf unter konstanter Dunkelheit / Beleuchtung in KO-Mäusen schwächer ausfällt als in Wildtyp-Mäusen. Eine weitere interessante Beobachtung ist die unterschiedliche Freilauf-Periodenlänge bei Dauerlicht. Diese Befunde zeigen, dass Melanopsin zwar wichtig, jedoch nicht essentiell für die Helligkeitswahrnehmung ist. 4

besitzt. Es zeigte sich weiterhin, dass die Melanopsin enthaltenden Ganglienzellen eine andere Morphologie besitzen als nicht photosensitive RGCs.

5 Literatur Originalveröffentlichungen J. Gooley, B. Saper et.al., Nature Neuroscience 4, 1165 (2001) S. Hattar, D.M. Berson, K.-W. Yau et.al., Science 295, 1065 (2002) D.M. Berson, M. Takao et.al., Science 295, 1070 (2002) N. F. Ruby, B. F. O Hara et.al., Science 298, 2211 (2002) S. Panda, I. Provencio, S. A. Kay et.al., Science 298, 2213(2002) R. J. Lucas, S. Hattar, M. Takao, D. M. Berson, R. G. Foster, K.-W. Yao, Science 299, 245 (2003) Zusammenfassungen M. Barinaga: How the brain s clock gets daily enlightenment, Science 295, 955 (2002) M. Menaker: Circadian Photoreception, Science 299, 213 (2003) Lehrbücher J. Dudel, R. Menzel, R. F. Schmidt: Neurowissenschaft, 2.Aufl., Springer Lehninger, Nelson, Cox: Biochemie, 3. Aufl., Springer 5

Hattar, M. Takao, D. M. Berson, R. G. Foster, K.-W. Yao, Science 299, 245 (2003) Zusammenfassungen M. Barinaga: How the brain s clock gets daily enlightenment, Science 295, 955 (2002) M.

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