Lichtmikroskopie und Computer: Sehen und Interpretieren diesseits und jenseits der Auflösungsgrenze

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1 Lichtmikroskopie und Computer: Sehen und Interpretieren diesseits und jenseits der Auflösungsgrenze Dieter G. Weiss Lehrstuhl für Tierphysiologie und Lichtmikroskopie-Zentrum Institut für Biowissenschaften Universität Rostock 1

2 Zweck der Bilder in der Wissenschaft Entdeckungsaspekt Rechtfertigungsaspekt (von Hypothesen) Verwertungsaspekt (Überzeugung, Publikation, Akzeptanz) 2

3 1. Sehen wie mit dem Auge Hellfeld-Mikroskopie Streulicht Dunkelfeld Mikroskopie Absorption des Lichts 3

4 Hellfeldmikroskopie Katzenfloh Micrasterias Leberegel Dendrocoelium 4

5 Dunkelfeldmikroskopie Katzenfloh Micrasterias Dendrocoelium 5

6 2. Physikalisch-optische Kontrastverfahren Kontrast-Technik Hellfeld Mikroskopie Dunkelfeld-Mikroskopie Phasenkontrast-Mikroskopie Differentielle Interferenzkontrast- Mikroskopie (DIC) Verwendete physikalische Eigenschaften des Lichtes Absorption Selbstleuchten (Tyndall-Effekt) Verzögerung der Ausbreitungsgeschwindigkeit (Phasenverschiebung) Polarisationsmikroskopie Interferenzmikroskopie Fluoreszenzmikroskopie doppelbrechende Objekte Interferenzerscheinung an dünnen Schichten, Brechungsindex Selbstleuchten (Fluoreszenz-Emission) 6

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8 Fluoreszenz-Mikroskopie tote und gefärbte Zellen Nachweis der Lokalisation einzelner fluoreszierender Moleküle Vitalmikroskopie: Nachweis des ph-werts, Spek ca 1940 Lokalisation von von Proteinen durch fluoreszierende Antikörper seit ca 1970 in der Zelle selbst gebildete fluoreszierende Proteine (GFP-Technik) seit ca 1980 dafür r Nobelpreis für f r Chemie

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11 Zellkulturen Kombination von hoher Auflösung und Fluoreszenzmikroskopie 11

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13 Nucleoli im Meiosekern der Schnake (Tipula): Pseudoräumliches Bild durch DIK: 2 kleine Objekte sind in Wirklichkeit ein optischer Schnitt durch einen Ring. Unten links richtiger Kontrast (Sonne von oben), rechts kopfstehendes Bild (Objekt erscheint als Vertiefung). 13

14 Klassische Lichtmikroskopie Auflösungsverm sungsvermögengen Auge Lichtmikroskop Elektronenmikroskop 0,2-0,3 mm bis zu 250 nm (2000-fache Vergrößerung) bis zu 0,1 nm ( fache Vergrößerung) Bakterien 1-21 µm Eukaryotenzellen µm Das Cytoskelett Actin-Filamente 7 nm Mikrotubuli 25 nm Organellen nm 14

15 Interpretationsbedarf Wo Unsichtbares zu Bildern wird 15

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19 2. Sehen mit elektronischen Augen Bilder sind beim Blick ins Mikroskop nicht sichtbar, erst nach Durchlaufen der analogen und digitalen Bildverbesserung Analoge Cameras (Videocameras) Analoge Kontrastverstärkung (Videomikroskopie), Überschreiten der Auflösungsgrenze der Mikroskopie, das neue Bild der Zelle Digitale Cameras (CCD und Restlicht-Cameras) Digitale Bildbearbeitung, digitale Spezialbilder, Messwertbilder, 19

20 neue Details mit Lichtmikroskopie: Bob Allen 1981 Video-Kontrastverstärkung: AVEC-DIC Marine Biological Laboratory, Woods Hole, Massachusetts das Cytoplasma wird wieder lebendig, Entdeckung der Motorenzyme 20

21 Video-Kontrast-Mikroskopie (AVEC-DIC) a b c 3 µm d e f 21

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24 Neuroblastom-Zelle axonaler Transport in proximalem Neuriten, real time,avec DIC 24

25 AVEC DIC: jenseits der Auflösungsgrenze der klassischen Lichtmikroskopie Conventional limit of resolution (human observer): Rayleigh criterion: approx lambda/2 (250 nm) New limit of resolution (machine vision): Sparrow criterion: approx 60% better (170 nm) 25

26 AVEC/DIC: die Grenze der Visualisierung Limit of visualization: organelles and latex beads: 20 nm colloidal gold particles 5 nm 26

27 Organellentransport Das Cytoskelett als Schienensystem New Methods New Insight Actin-Filamente 7 nm Mikrotubuli 25 nm Organellen nm Auflösungsgrenze der konventionellen Lichtmikroskopie: etwa nm Visualisierungsgrenze der Video-Mikroskopie etwa nm 27

28 Cytoplasma aus dem Tintenfisch-Riesenaxon Transport an freien Mikrotubuli uns Actin-Filamenten 28

29 Transport synaptischer Vesikel in der Nervenzelle V = 0,5...5 µm/s AVEC-DIK- Mikroskopie Allen videoenhanced differential interference contrast microscopy 29

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31 Entdeckung der drei Motorenzyme: Kinesin, Dynein und cytoplasmatisches Myosin 31

32 Hochauflösende Lebendzell-Mikroskopie Lichtmikroskopie-Zentrum Rostock im Institut für Biowissenschaften 32

33 Video-Kontrastverstärkungs-Mikroskopie nach Allen (AVEC) eignet sich für ungefärbte, extrem kontrastarme Objekte und für extreme Vergrößerungen an lebenden Objekten. Mit DIK und POL sind Objekte darstellbar, die 20x kleiner sind als die klassische Auflösungsgrenze. Torsten Wöllert am Reichert Polyvar Met mit zwei Hamamatsu Photonic Microscope Systems C1966 für Ringvorlesung AVEC und VIM. Bilder

34 Qantitative Bewegungsanalysen von Organellen 34

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36 Extrem schwache Fluoreszenz: Wo Unsichtbares zu Bildern wird Video Intensified Microscopy VIM (Restlichtmikroskopie) - Verwendung von Restlichtkameras Restlichtmikroskopie - arbeitet im Bereich, in dem das Auge nicht mehr arbeiten kann, d.h. weniger als 10 6 Photonen / mm² s - kann jedes einzelne Photon auffangen, d.h. Grenze 10 0 Photonen / mm² s - dadurch fast keine Fluoreszenzfarbstoffe und kaum Lichtbestrahlung notwendig Toxizität wird herabgesetzt, was für die Zelle weniger schädlich ist Lokalisation von Einzelmolekülen 36

37 3, 4 und 5 D-Mikroskopie Leica TCS SP2 AOBS spektrales konfokales Mikroskop mit Zellkultur-Inkubations-Box 37

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39 4D-Videomikroskopie von Zellen (x,y,t,conc) 6 hours video phase contrast GFP-Fluoreszenz: Nervenzell-Vorläuferzellen Nach Start der Differenzierung wird ein neues Protein exprimiert 39

40 Messung von im Zellkern: blau Zellkernfärbung, definiert das Volumen, rot beta-catenin wird nur in diesem Volumen bestimmt protein of interest β-catenin nuclei pab β-catenin + Alexa594 40

41 Fluoreszenz-Intensitätswerte für jede Zelle 39,73 50,63 46,77 45,51 39,89 51,24 44,74 36,23 45,61 47,45 36,91 49,94 38,74 37,46 50,31 45,67 39,76 37,39 56,94 39,25 60,75 protein of interest β-catenin nuclei pab β-catenin + Alexa594 progress over time 41

42 nuclear β-catenin signal quantification 3 fluorescent intensity normalized +/- SD 2,5 2 1,5 1 0, time of differentiation [h] nuclear β-catenin signals 6 independent experiments, n ~ 150 per timepoint and experiment control +/- SEM 42

43 Mathematische Modellierung erlaubt Beantwortung von Fragen, die experimentell kaum zugänglich sind Schmitz, Y, Bader, BM, Weiss, DG, Wolkenhauer, O and Rateitschak, K (2008). Elucidating the role of nucleo-cytoplasmic shuttling of ß-catenin antagonists by mathematical modelling, "Summer School on Systems Biology for Medical Applications Tenerife, Spain,

44 Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) Time of halfrecovery as a means to quantify intra-cellular transport z.b. 72 sec 44

45 Cell cycle Human immune relevant cells (Monocytes) Mitosis Control cells Mimosine G 1 Stopp Nocodazole G 2 /M Stopp Microtubule DAPI Microtubule DAPI Microtubule DAPI by M. Lantow & J. Strompen, Live Cell Imaging Center, Rostock 45

46 Live Cell Imaging Reactive oxygen species production after phorbol ester treatment (tumour promotor) in human immune relevant cells (Monocytes) Phase contrast Rhodamine 123 fluorescence Nikon Biostation, 20 x, 3 h in 6 sec by M. Lantow & J. Strompen, Live Cell Imaging Center, Rostock 46

47 Microtubule interfering drugs Control cells Microtubule DAPI Microtubule Drug treated Cytostatikum DAPI by H. Lemcke, Live Cell Imaging Center, Rostock 47

48 Lichtmikroskopie-Zentrum Rostock Confocal Microscopy of Cornea Cells Optische Mikroskopie von 1x bis x : alles in einer Hand GFP-α-Tubulin Gene Expression Video Microscopy Multi Channel Immunofluorescence 48

49 Lichtmikroskopie-Zentrum Rostock Ausrüstung und Verfahren Imaging Light Microscopy 1. Phase contrast, differential interference contrast, dark field and fluorescence microscopy 2. Video rate confocal laser scanning microscopy 3. Video-enhanced contrast microscopy according to Allen (AVEC) 4. Video-intensified microscopy (VIM) 5. Supravital UV-video microscopy 6. Fluorescence-In-Situ-Hybridization (FISH) Measuring Light Microscopy 7. Ratio imaging 8. Micro-spectrophotometry and micro-spectrofluorometry 9. Laser velocimetry microscope 10. Fourier-Interferometric Image Analysis (FIBA) 11. Cell electrophoresis microscope 12. Double-beam interference microscope 13. Dynamic Phase Microscopy (DPM) Special techniques for living cells 14. Cell culture laboratory 15. Microscopy of living cultures 16. Patch-clamp stand Micro-manipulation techniques 17. Microscopy in a magnetodrom 18. Micro-injection 19. Flash photolysis 20. Laser dissecting microscope 21. Laser tweezers 22. Electroporation Micro Sensor-Array-Techniques and Sensor Development Laboratory 23. Hybrid cell silicium-sensor array systems 24. Micro-electrode arrays for analysis of neuronal network activity Special Techniques for 25. Preparation laboratory for bio-chips 26. Electronic work shop Video-, Image-, and Data-Processing 27. Analogue and digital real time image processing 28. Video micro-cinematography and computer-aided video studio 29. Digital image analysis D rendering system 31. Video motion analysis system 49

50 Biophysik in der Zelle: Membranpotential - elektrische Ladung (= Membranpotential) wird durch Fluoreszenzfarbstoffe in der Membran sichtbar gemacht Biochemie in der Zelle: ATP - Luciferase verwendet Energie (ATP), um Lichtquanten auszusenden - jedes ATP kann ein Lichtquant abgeben, so wird Konzentration vom ATP gemessen ATP + Luciferin Luciferase hυ + ADP + Pi Tumor-Kultur ( Mikroshäre von 1 mm Durchmesser, Zellen in der Mitte haben kein ATP, d.h. sind tot) 50

51 Das Konzept des "Zell-Observatoriums Rostock". Lebende Zellen werden durch eine Testbatterie von mikroskopischen und spektroskopischen Verfahren (Detektor 1) (Lichtmikroskopiezentrum) und durch multiparametrische Mikrosensoren in Silizium oder Dünnschichttechnik (Detektor 2) (Innovationsnetzwerk Biosystemtechnik) nicht-invasiv analysiert. 51

52 Stichlaser, Nervenzelle 52

53 Entwicklung von neuen Methoden begleitet den Erkenntnisfortschritt 1. Erste Phase: Erfindung des Mikroskops: es gibt Zellen 2. Klassische Lichtmikroskopie: Handwerkliche Herstellung von Mikroskopen Die Zellenlehre: alle organismen bestehen aus Zellen 3. Wissenschaftlicher Mikroskopbau Erreichen der physikalischen Auflösungsgrenze Dynamik der größ ößeren Zellbestandteile: Chromosomen 4. Elektronenmikroskopie: Ultrastruktur der toten Zelle: Proteine und Cytoskelett 5. Elektronische und computergestützte tzte Lichtmikroskopie I. Allen-Videomikroskopie: Das Cytoskelett lebt II.Fluoreszenz-Videomiroskopie Videomiroskopie: Lokalisation der Mole küle in der Zelle III. Konfokale Laser-Raster Raster-Mikroskopie: Zellen in 3D IV. Cytomics: die gesamte Zelle wird vermessen V. Systembiologie: Computersimulation der Zelle 53

54 Betrachtung mit dem Auge: Auge Dokumentation Hellfeld-, Dunkelfeld, Bewaffnung des Auges, Erweiterung der Auflösungsgrenze des Auges Physikal.-optische Spezial-Kontrastverfahren: Visualisierung von physikal.. Eigenschaften, interpretationsbedürftig Betrachtung mit elektronischen Cameras Analoge Kontrastverstärkung (Videomikroskopie), Überschreiten der Auflösungsgrenze der Mikroskopie, das neue Bild der Zelle Digitale Bildbearbeitung, digitale Spezialbilder, Messwertbilder Interpretiertes Bild (Abstraktion aus vielen Bildern, Krstic) ( Betrachtung mit dem Gehirn ) 54

55 Mitarbeiter Partner Sergei A. Kuznetsov Torsten Wöllert Willfried Kröger Eik Hoffmann Simone Stüwe Benjamin Bader Bärbel Redlich Margareta Lantow Heiko Lemcke Jennifer Strompen Gerald Grümmer Fa. HaSoTec Rostock George M. Langford Dartmouth College, NH Vladimir P. Tychinsky, MIREA Moscow Walter Steffen King s College London 55

56 Luftblase in Öl 56