Mikroskopie in der Biochemie

Transkript

1 Mikroskopie in der Biochemie Dr.H.Schlichting

2 Konventionelles Lichtmikroskop Antonie van Leuuwenhoeck, fach, 1,3 um

3 Konventionelles Lichtmikroskop Verbessertes Design, John Yarwell, 1680

4 Optische Abbildung Werkzeug Unterschiedliche Brechungsindices -> Unterschiedliche Lichtgeschwindigkeiten Anwendung Gekrümmte Flächen

5 Optische Abbildung, reelles Bild (Projektor) Objekt zwischen f und 2f : Reelles Bild das auf dem Kopf steht

6 Optische Abbildung, virtuelles Bild (Lupe) Objekt zwischen 0 und f : Virtuelles Bild seitenrichtig

7 Optische Abbildung, Vergrößerung Definition der Vergrößerung

8 Optische Abbildung, Linsenfehler

9 Lichtmikroskop: Strahlengang

10 Lichtmikroskop: Vergößerung <-> Auflösung Abbe 1900: Die Auflösung eines Mikroskops ist durch die Licht-Wellenlänge auf λ/2 beschränkt. Definition Apertur

11 Lichtmikroskop: Apertur, Ölimmersion Typische Objektive Billig: Apertur 0.1 Auflösung 2,75µm Hochwertig: Apertur 0,65 Auflösung 0,42µm Öl: Apertur 1,4 Auflösung 0,20µm

12 Lichtmikroskop Kontraststeigerung: Hellfeld / Dunkelfeld Hellfeld: Kreisförmige Blende Transmission Dunkelfeld: Ringförmige Blende Sichtbar sind Umrisse und Beugung

13 Vergleich Hellfeld / Dunkelfeld Hellfeld Dunkelfeld Erythrozyten ca 7µm

14 Phase, Welleneigenschaften Wellenfronten als Überlagerung von Punktwellen Hauptmaximum & 1. Nebenmaximum

15 Phase, Welleneigenschaften 2 Spalte dicht beieinander Nebenmaxima weit weg vom Hauptmaximum -> starke Störung des Hauptmaximums da gut sichtbar 2 Spalte in Abstand Nebenmaxima nah am Hauptmaximum -> wenig Störung des Hauptmaximums da schlecht sichtbar

16 Phasenkontrast-Mikroskop Prinzip 1) Abschattung durch Ringblende vor Eintritt in Objekt 2) Phasendrehung durch λ/2 Plättchen nur des Objektlichtes 3) Mischung Objektlicht und Direktlicht

17 Phasenkontrast-Mikroskop Zusätzliche Phasendrehung durch λ/2 Plättchen Interferenz in der Zwischenbildebene 1.Phasendrehung im Objekt bis zu λ/2

18 Vergleich Phasenkontrast Normal Phasenkontrast

19 Differencial Interference Contrast = DIC Prinzip 1) Strahlaufspaltung hinsichtlich Polarisation vor Eintritt in Objekt 2) Seitlich versetzter Durchgang der polarisierten Strahlen durch Objekt 3) Mischung der unterschiedlichen Polarisationen nach Durchgang

20 Vergleich DIC Normales DIC misst n s PlasDIC misst s Befruchtete Eizelle einer Maus vor der Kernverschmelzung

21 Konfokales Mikroskop Transmission Prinzip 1) Punktförmige Beleuchtung des Objekts durch 1.Blende. Fokussierung auch in 3.Dimension 2) Detektion der Objektstrahlen die in unterschiedlichen Ebenen fokussieren hinter 2. Blende. Falsche Ebenen liefern reduzierten und diffusen Beitrag 3) Bildgebung durch 3D-Scannen Reflektion

22 Konfokales Mikroskop

23 Vergleich Konfokal Zelle mit Teilungsapparat

24 4Pi-Mikroskop Prinzip 1) Beleuchtung des Objekts von 2 Seiten bei vollem Raumwinkel 2) Bildgebung durch 3D-Scannen Auflösungs unter 100 µm auch in 3D

25 4Pi-Mikroskop

26 Historie 1600 Drebbel 1. Mikroskop 1890 Abbe Theorie 1913 Lehmann, Prowazek Fluoreszenz 1941 Zernike Phasenkontrast Nobelpreis 1955 Nomarski DIC 1957 Minski Konfokal 1982 Binning, Rohrer STM Nobelpreis 1986 Binning, Gate, Gerber AFM 1990 Hell 4Pi

27 Atomic Force Microscope = AFM Prinzip 1) Andrücken einer sehr dünnen federnden Spitze gegen das Objekt 2) Messung der Gegenkraft durch Federverbiegung, meist mittels abgelenktem Laserstrahl 3) Bildgebung durch 2D-Scannen Auflösungs unter 10 nm Spitze

28 AFM Betriebsmodus Betriebsmodi 1) Kontakt-Modus: Ungünstig da zerstörend bei hohen Strukturen 2) Abstands-Modus: Instabil da Kraft/Abstandskurve Hysterese aufweist 3) Oszillations-Modus: Nichtzerstörend, stabil, aber aufwendig

29 AFM: Resonant Mode Resonant Mode: Schwingende Spitze Abstandsmessung durch Verschiebung der Resonazfrequenz aufgrund der Dämpfung

30 AFM CD Membranverdau Chromosomen DNA

31 Nearfield Scanning Optical Microscopy = NSOM Abbe 1900: Die Auflösung eines Mikroskops ist durch die Licht-Wellenlänge auf λ/2 beschränkt. Nur richtig für Wellenausbreitung des Lichts = Fernfeld Im Nahfeld - unterhalb einer Lichtwellenlänge - ist die Ausbreitung von Licht exponentiell gedämpft. Aber nicht null! Durch geeignete Strukturen kann man Licht auch hier "führen". 1. Vorschläge: 1928 Synge, 1956 O'Keefe Nachweis mit Mikrowellen bei λ/60 Auflösung 1972 Ash, Nichols 1. Gerät 1984 Lewis, Isaacson, Harootunian Murray

32 NSOM Prinzip

33 NSOM Prinzip Prinzip 1) AFM-Spitze im non contact mode mit Lichtaustrittsöffnung 2) Globale Detektion des in Nahfeld beeinflußten Lichts 3) Bildgebung durch AFM-kontrolliertes 2D-Scannen Auflösungs bis 20 nm

34 NSOM Modi Spitzentypen

35 NSOM Auflösung Muskelzelle Aluminiummuster unter Wasser

36 NSOM Auflösung Tabakmosaik-Virus AFM NSOM Optische Auflösung 18nm = λ/25

37 Nearfield Scanning Micowave Microscopy = NSMM

38 NSMM Prinzip Prinzip 1) AFM-Spitze im non contact mode mit Mikrowellenaustrittsöffnung 2) Globale Detektion der in Nahfeld beeinflußten MW- Strahlung 3) Bildgebung durch AFM-kontrolliertes 2D-Scannen Auflösungs aktuell um 200 nm liefert Informationen aus dem Materialinneren!

39 NSMM Spitze

40 NSMM Prinzip

41 NSMM Prinzip

42 NSMM Prinzip

43 Prinzip der Fluoreszenz Niveauschema der Fluoreszenz-Anregung

44 Farbstoffe Konventionelle Fluoreszenz-Farbstoffe

45 Green Fluorescent Protein - GFP Prinzip GFP 1) DNA die ein bestimmtes Protein herstellt steht zur Verfügung 2) In einer Zelle, z.b. einem Bakterium, wird die DNA verwendet um das Protein herzustellen (zu exprimieren) 3) Zuvor kann in der DNA eine Sequenz eingefügt werden die zusätzlich das GPF (ein relativ kleines Molekül) an dem gewünschten Protein "anbringt" Damit ist ein markiertes Protein hergestellt, das zumeist noch die gleiche Funktionalität aufweist. GFP

46 Fluoreszenz Mikroskop Prinzip 1) Das Objekt (meist Zelle mit GFP-markiertem Protein) wird mit Licht der Anregungsfrequenz bestrahlt. 2) Über einen Strahlteiler und nach selektion der Emissionswellenlänge wird das emittierte Licht aufgefangen. 3) Auflösung je nach Mikroskoptyp: Lichtmikroskop Phasenkontrast Konfokal 4Pi NSOM

47 Fluoreszenz Bilder Zelle markiert mit 2 Farbstoffen

48 Fluoreszenz Bilder Normale Fluoreszenz NSOM-Fluoreszenz Einzelne Fluoreszenzmoleküle!

49 Mikroskop-Typen Normales Lichtmikroskop Phasenkontrast-Mikroskop DIC-Mikroskop Konfokales Mikroskop 4Pi-Mikroskop NSOM AFM Fluoreszenz-Technik NSMM Auflösung bis 200 nm Erhöhter Kontrast Erhöhter Kontrast, Höhenmessung 3D-Bilder, Auflösung bis 150 nm Auflösung bis 70 nm Auflösung bis 20 nm Auflösung bis 10 nm Kraft-Messung Auflösung wie Träger-Mikroskop extremer Kontrast, einzelne Atome leuchten Auflösung bis 200 nm Messung der Dielektrizitätskonstante