Grundlagen der Durchflusszytometrie. Dipl.-Ing. Markus Hermann

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1 Grundlagen der Durchflusszytometrie 1

2 Durchflusszytometrie Definition : Automatisierte Licht- und Fluoreszenzmikroskopie an Einzelzellen im kontinuierlichen Probendurchfluss! FACS: Fluorescence activated cell sorting! 2

3 Aufbau eines Durchflusszytometers Fluidik Laser Optik Detektion hydrodynamische Fokusierung Argonlaser 488nm (blau) He-Ne 633 nm (rot) Flowzelle, optische Bank mit Linsen, Prismen und Filtern Photomultiplier Tube (PMT) 3

4 Eigenschaften eines Durchflusszytometers Methode Laser (488 nm oder 633nm) Einzelpartikel (0,5-50!m) Lichtstreuung Fluoreszenzsignale 4

5 Hydrodynamische Fokusierung Flow Cell Sheath Fluid Hüllflüssigkeit 5

6 LASER optische Bank FC 500 Flow Cell Side Scatter 500LP 620SP FL3 Forward Scatter FL1 525BP 575BP 755BP 675BP FL4 Filtertypen 500LP 615DSP 620SP 710DLP 755BP ±15 488DLP FL2 FL2 FL5 FL5 6

7 Strahlengang FC500 7

8 Lichtstreueigenschaften der Zellen Zellgranularität Side Scatter Detector (SSC) 90º Forward Scatter Detector (FSC) Zellgröße 8

9 Lichtstreueigenschaften der Zellen Side Scatter Detector Forward Scatter Detector Side Scatter Detector Forward Scatter Detector 9

10 Photomultiplier Tubes (PMT)!!!!! Photoemission an Photokathode Photoelektronen (beschleunigt) treffen auf Dynoden => Sekundärelektronen Elektronen treffen auf Anode => Ausgangssignal Konvertieren Licht in einen analoges Signal (Spannung) Die Höhe des Signals wird über die an der PMT angelegte Spannung kontrolliert. 10

11 PMT: Scatter-Einstellung Gut Schlecht 11

12 PMT: Fluoreszenz-Einstellung Gut Schlecht PMT Spannung zu niedrig Fl 1 Fluoreszenzintensität Schlecht PMT Spannung zu hoch 12

13 Vorteile der Durchflusszytometrie!!Erfassung großer Zellzahlen innerhalb kurzer Zeit auch seltene Ereignisse sind gut messbar.!!gleichzeitige Erfassung von zwei morphologischen und bis zu fünf Fluoreszenzparametern je Zelle!!Computeranalyse ermöglicht Typisierung von Subpopulationen 13

14 Probenmaterial Bakterien Hefen Vollblut Zellkulturen Trypanosomen Knochenmark Tumorzellsuspensionen Durchflusszytometrie 14

15 Vollblutanalyse Morphologische Differenzierung anhand des Streulichts Immunologische Differenzierung mit Hilfe einer Antikörpermarkierung CD14-PE Lymphozyten Monozyten Granulozyten CD45-FITC 15

16 Zellfärbungen 16

17 Ausbau und Prinzip eines FACS Sorting in two or more container Charged cells are separated 17

18 Cell Cycle associated Antigens 18

19 Zell-Zyklus - DNA Gehalt G1 G0 M G2 early S mid S late S 19

20 DNA Farbstoffe!!! DNA can be stained by dyes that intercalate into the double strand The staining is stoichiometric, i.e. the amount of dye bound is directly proportional to the amount of DNA present in the cell The dye has to enter the nucleus to stain the DNA strands!! Excitable by 488nm laser light:! Propidium iodide! Acridine Orange! Ethidium bromide Excitable by UV light:! DAPI! Hoechst 20

21 DNA-Färbung mit PI G2-M Permeabilisierung der Zell- und der Kernmembranen PROPIDIUM IODID Höhere Leuchtintensität oben G1 21

22 Zell-Zyklus - Diagramm G1 S Fluoreszenzintensität M G2 22

23 Diskriminierung von Dubletten Problem: Ziel: Zwei nicht getrennte Einzelzellen besitzen denselben DNA- Gehalt, wie eine G2/M Zelle! Trennung dieser beiden Fälle. Fokusdurchmesser < Zelle Peakfläche proportional zu DNA Gehalt Peakhöhe nicht proportional 23

24 Diskriminierung von Dubletten Problem: Ziel: Zwei nicht getrennte Einzelzellen besitzen denselben DNA- Gehalt, wie eine G2/M Zelle! Trennung dieser beiden Fälle. Fokusdurchmesser < Zelle Peakfläche proportional zu DNA Gehalt Peakhöhe nicht proportional Gate Single Cells 24

25 Drug Treatment and Cell Cycle 0h 5h Zugabe der Substanz zum Zeitpunkt 0h ins Medium. Zellen werden weiter inkubiert. Probennahme zu den jeweils aufgeführten Zeitpunkten. 16h 48h 24h 25

26 0h Treatment with Nocodazol 8h Noc 24h Noc 32h Noc 32h ohne Noc Nocodazol: Depolymerisation von Microtubuli 26

27 Treatment with Thymidine 24h ohne thymidine 24h thymidine 27