UE Biochemie II: Flow Cytometry

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1 UE Biochemie II: Flow Cytometry Lerninhalt: Grundlagen der Durchflußzytometrie: Forward Scatter, Side Scatter, Fluoreszenzintensität; FACS; Lymphozytenpräparation über Ficoll; Hintergrund: Siehe Vorlesung Zeitplan: Die Übungsteile werden je nach Gruppe in folgender Reihenfolge durchgeführt: Gruppen 1-4: Teil 1, Teil 2, Teil 3B, Teil 3A, Teil 4 Gruppen 5-8: Teil 1, Teil 3A, Teil 2, Teil 3B, Teil 4 Aufgabenstellung des Versuches: 1. Übung am FACS Simulator Am virtuellen FACS sollen Sie sich mit den Einstellungen der Detektoren und der Kompensation vertraut machen. Simuliert wird ein FACS mit 3 Farben (FL1 = FITC, FL2 = PE, FL3 = PerCP/Cy5.5). Als Proben werden zum Einstellen der Kompensation verschieden markierte Beads simuliert, sowie eine lysierte Vollblutprobe und eine Ficoll gereinigte Blutprobe lysiert. Diese Proben werden Sie später im Praktikum auch selber herstellen und am echten Gerät messen. a. In PLUSonline können Sie unter interaktive Beispiele/Experimente einen FACS Simulator herunterladen. Speichern Sie das Verzeichnis FACS Simulator auf Ihren Laptop und starten Sie das Programm durch anklicken der Datei FACS_Simulator.html. Es ist keine Installation erforderlich. b. Arbeiten Sie die Übungsbeispiele Schritt für Schritt durch. Die Tutoren werden Ihnen dabei helfen. c. Zeigen Sie die Ergebnisse jeder Aufgabe dem Tutor. 2. Lymphozytenpräperation Sie sollen mittels einer isopyknischen Dichtegradientenzentrifugation die Lymphozyten aus einer Milzzellsuspension reinigen. Dazu erhalten Sie von den Tutoren 300µl Milzzellsuspension. a. In ein 1.5ml Eppi werden 500µl Ficoll vorgelegt b. Ficoll vorsichtig mit 500µl Milzzellsuspension überschichten

2 c. Anschließend werden die Proben 25min bei 2200rpm (1000g) in einem Ausschwingrotor zentrifugiert i. Aufgrund ihrer höheren Dichte sammeln sich die Erythrozyten und Granulozyten am Boden des Eppis ii. Die Lymphozyten, Monozyten und NK-Zellen sammeln sich in einer milchig trüben Interphase an d. Interphase mit der Pipette aufsaugen und in ein 1.5ml Eppi transferieren i. Es macht nichts, wenn Sie von der oberen wässrigen Phase etwas mit abheben. Vermeiden Sie aber, die unter Ficoll Phase mitzunehmen! e. Probe mit 1ml FACS-Buffer (PBS, 0.5% FCS, 2mM EDTA) auffüllen (waschen) f. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentrifuge zentrifugieren i. Markieren Sie, welche Seite des Eppis nach außen zeigt (oder besser: stellen Sie das Eppi so in die Zentrifuge, dass das Scharnier nach außen zeigt). Die Zellen kleben nach der Zentrifugation im Festwinkelrotor auf der Seite des Eppis und sind nicht unbedingt in einem Pellet am Boden. g. Waschen 1 x wiederholen h. Probe mit FACS-Buffer auf 200µl auffüllen und auf Eis stellen

3 3. Färbung für die Flow Cytometrie Teil A) Sie erhalten von den Tutoren 50µl heparinisiertes (verhindert die Blutgerinnung) Maus Vollblut. Das Verhältnis der im Vollblut enthaltenen enthaltenen B- bzw. T-Zellen soll mittels Flow-Cytometry bestimmt werden. Außerdem sollen die Subtypen der T-Zellen bestimmt werden (CD4 = T-Helferzellen; CD8 = cytotoxische T-Zellen). Dazu werden die entsprechenden CD Antigene mit fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern markiert (CD3 = alle T-Zellen; CD19 = alle B-Zellen). Vor der Analyse müssen noch die Erythrozyten durch Lyse mittels eines hypotonen Puffers (FACS-Lyse) entfernt werden. Um exakte Werte zu erhalten wird zusätzlich mit einem Marker für alle weißen Blutkörperchen (CD45) gefärbt. So kann der prozentuelle Anteil der Einzelnen Zellklassen an der Gesamtmenge der Leukozyten bestimmt werden a. Sie erhalten von den Tutoren in FACS-Buffer vorverdünnte Antikörper: i. anti-cd3-fitc + anti-cd19-pe + anti-cd45-percp-cy5.5 jeweils 1:50 verdünnt ii. anti-cd4-fitc + anti-cd8-pe + anti-cd45-percp-cy5.5 jeweils 1:50 verdünnt b. Blutprobe resuspendieren und auf 2 x 20µl in frische Eppis aufteilen c. Eine Probe mit 20µl CD3/CD19/CD45 Färbemix mischen, die andere mit 20µl CD4/CD8/CD45 mix. ( Endkonzentration der Antikörper 1:50) d. Proben 15min auf Eis inkubieren e. Röhrchen mit 1ml FACS-Buffer auffüllen (waschen) f. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentzrifuge zentrifugieren g. Überstand vorsichtig abheben und Pellet in 200µl FACS-Lyse resuspendieren. Das Pellet muss völlig gelöst sein, es dürfen keine Reste an der Eppiwand kleben! i. FACS-Lyse ist eine hypotone Salzlösung. Dadurch nehmen die Zellen Wasser auf und die Erythrozyten platzen auf. Die Leukozyten schwellen auch an, zerplatzen aber nicht. h. 10min bei RT inkubieren. Erythrozyten lysieren, und die Probe wird klar. i. Röhrchen mit 1ml FACS-Buffer auffüllen (waschen) j. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentzrifuge zentrifugieren k. Überstand vorsichtig abheben und Pellet in 200µl FB resuspendieren l. Probe auf Eis stellen m. Auswertung am Flow-Cytometer: i. Die Kompensationseinstellungen am Gerät sind bereits richtig voreingestellt. ii. Nehmen Sie einen USB-Stick mit. Sie erhalten ihre Daten und können sie selber mit der WinMDI Software auswerten (Punkt 4).

4 Teil B) Die in Punkt 2 gereinigten Leukozyten werden wie in Punkt 3A analysiert. a. Sie erhalten von den Tutoren in FACS-Buffer vorverdünnte Antikörper: i. anti-cd3-fitc + anti-cd19-pe + anti-cd45-percp-cy5.5 jeweils 1:50 verdünnt ii. anti-cd4-fitc + anti-cd8-pe + anti-cd45-percp-cy5.5 jeweils 1:50 verdünnt b. Probe resuspendieren und auf 2 x 20µl in frische Eppis aufteilen c. Eine Probe mit 20µl CD3/CD19 Färbemix mischen, die andere mit 20µl CD4/CD8 mix. ( Endkonzentration der Antikörper 1:50) d. Proben 15min auf Eis inkubieren e. Röhrchen mit 1ml FACS-Buffer auffüllen (waschen) f. 5min bei 2000rpm (300g) in Eppizentrifuge zentrifugieren g. Überstand vorsichtig abheben und Pellet in 200µl FB resuspendieren h. Probe auf Eis stellen i. Auswertung am Flow-Cytometer: i. Die Kompensationseinstellungen am Gerät sind bereits richtig voreingestellt. ii. Nehmen Sie einen USB-Stick mit. Sie erhalten ihre Daten und können sie selber mit der WinMDI Software auswerten (Punkt 4). 4. Auswertung mittels WinMDI Mittels der Freeware Software WinMDI können Sie Ihre Daten selber auswerten. Machen Sie sich mit der Software vertraut. Die Tutoren helfen Ihnen dabei. a. In PLUSonline können Sie unter interaktive Beispiele/Experimente die WinMDI Software herunterladen. Speichern Sie das Verzeichnis WinMDI 2.9 auf Ihren Laptop und starten Sie SETUP.exe um die Software zu installieren. i. Die Software läuft NICHT auf 64-bit Betriebssystemen b. Im Verzeichnis Demofiles finden Sie Beispieldateien mit den entsprechenden Proben/Färbungen, so wie Sie sie auch im Praktikum durchführen. c. Sie können Ihre Daten als Dotplot (jeder Punkte ist ein Event, bzw. eine Zelle), oder als Density bzw. Contour Plot anzeigen lassen (die

5 Verteilung der Zellen wird farblich, bzw. durch Höhenlinien dargestellt). d. Die wichtigsten Funktionen: i. Mit der rechten Maustaste auf einen Plot klicken: Untermenü erscheint. ii. Unter Regions können Sie verschiedene Regionen definierten. iii. Unter Quadrant können Sie den Plot in 4 Regionen (Quadranten) aufteilen. iv. Unter Gate, können Sie auswählen, dass nur Zellen dargestellt werden, die innerhalb einer bestimmten Region liegen. v. Unter Stats wird angezeigt, wieviele Events (Zellen) in der jeweiligen Region, bzw. im jeweiligen Quadranten liegen. e. So werten Sie z.b. eine CD4/CD8 Färbung aus: i. Öffnen sie das File als Dotplot und stellen Sie FSC auf der X- Achse und SSC auf der Y-Achse dar (beides linear) ii. Öffnen Sie das File ein zweites Mal als Dotplot und stellen Sie auf der X-Achse FL1 (CD4-FITC) und auf der Y-Achse FL2 (CD8-PE) dar (beides logaritmisch). iii. Zeichnen Sie im FSC/SSC Plot eine Region R1 um die Lymphozyten. iv. Aktivieren Sie im FL1/FL2 Plot die Region R1 als Gate. D.h. dass nur die Zellen die im FSC/SSC Plot innerhalb von Region R1 liegen (die Lymphozyten) im FL1/FL2 Plot dargestellt werden. Das Ergebnis sollte ungefähr wie folgt aussehen:

6 Side Scatter Granularität der Zellen Eosinophile Granulozyten Debris Bruchstücke toter Zellen, Reste von Erythrocyten, Dreck Neutrophile Granulozyten Monozyten Gate auf Lymphozyten Lymphozyten (B- und T-Zellen) Forward Scatter Größe der Zellen Die Zellen im Lymphozytengate, werden dann weiter analysiert. In diesem Beispiel auf CD4 und CD8: CD8 positive Zellen (Cytotoxische T Zellen) Extrathymische CD4+CD8+ Zellen CD4/CD8 negative Zellen aus dem Lymphozytengate (müssen daher B- Zellen sein) CD4 positive Zellen (Helferzellen)

7 Auswertung Ihrer Daten: Ein noch besseres Ergebnis erhalten Sie, wenn Sie vorher noch auf die gesamt Leukozyten gaten. So vermeiden Sie, dass Kontaminationen wie Zellreste, verbliebene Erythrozyten, etc. in die Auswertung mit einfließen. Ermitteln sie folgende Daten aus Ihren Proben, bzw. aus den n. 1) Vollblutprobe Anteil der folgenden Zellpopulationen an den gesamten Leukozyten: Lymphozyten Neutrophile Monozyten Anteil der T- bzw. B-Zellen an den Lymphozyten: T-Zellen B-Zellen Anteil der CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen an den Lymphozyten: CD4+ T-Zellen CD8+ T-Zellen 1) Ficoll gereinigte Milzzell Probe Anteil der folgenden Zellpopulationen an den gesamten Leukozyten: Lymphozyten Neutrophile Monozyten Anteil der T- bzw. B-Zellen an den Lymphozyten: T-Zellen B-Zellen Anteil der CD4+ bzw. CD8+ T-Zellen an den Lymphozyten:

8 CD4+ T-Zellen CD8+ T-Zellen