VERSUCH 3: ERSTELLEN EINES BLUTBILDES

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1 VERSUCH 3: ERSTELLEN EINES BLUTBILDES LERNZIELE: 1) Immunphänotypisierung allergischer vs. naiver Mäuse 2) Auswertung von FACS Daten mittels Cyflogic Software 3) Statistischer Vergleich zwischen den Gruppen HINTERGRUND: VORBEMERKUNG: In diesem Übungsbeispiel erstellen Sie ein detailliertes Blutbild von allergischen Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen. Jede Gruppe bekommt eine Blutprobe von einer anderen Maus. Insgesamt werden 4 allergische und 4 naive Mäuse untersucht. Sobald alle Proben gemessen wurden, tauschen Sie die Daten untereinander aus und erstellen für die einzelnen Blutwerte Diagramme. Es folgt eine statistische Auswertung, welche Blutparameter sich zwischen allergischen und naiven Mäusen statistisch unterscheiden. BLUTBILD: Die Analyse des Blutbildes mittels Durchflusszytometrie bietet einen detaillierten Überblick über die zellulären Bestandteile des Blutes, in unserem Fall die weißen Blutkörperchen (Leukozyten). Mit Hilfe des Blutbildes können bestimmte Krankheitsbilder diagnostiziert werden. Allerdings gibt es recht große Schwankungen innerhalb der sogenannten Normalwerte. In Tabelle 1 sehen Sie die Normalwerte von weiblichen BALB/c Mäusen. BALB/c Mäuse werden in der

2 Allergieforschung bevorzugt eingesetzt, da sie eine genetische Prädisposition besitzen, Th2 Immunantworten (allergische Immunantworten) zu induzieren. Die Mäuse, deren Blut Sie im Praktikum untersuchen sollen, sind gegen das Gräserpollenallergen Phl p 5 sensibilisiert worden. Dazu wurde den Mäusen das rekombinante Allergen gemeinsam mit dem Adjuvans Aluminium Hydroxid mehrmals subkutan injiziert. Das gleiche Adjuvans wird in vielen Humanimpfstoffen eingesetzt. Im Falle von BALB/c Mäusen fördert es die Entstehung einer allergischen Immunantwort, die durch hohe Titer von allergenspezifischen IgE Molekülen charakterisiert ist. TABELLE 1. NORMALWERTE VON ERWACHSENEN, WEIBLICHEN BALB/C MÄUSEN. WBC = white blood cells, RBC = red blood cells, MCF = mean corpuscular volume (durchschnittliche Größe der Erythrozyten, angegeben in Femtolitern). Quelle: Generell ist in Allergikern die Zahl der Leukozyten pro ml Blut im Vergleich zu Nichtallergikern erhöht. In schweren Fällen kann auch der Anteil an eosinophilen Granulozyten erhöht sein. Ob die Sensibilisierung das Blutbild tatsächlich signifikant verändern kann, werden Sie in diesem Praktikum untersuchen. BESTIMMUNG DER ZELLZAHL Um die genaue Zellzahl in Ihrer Blutprobe zu bestimmen haben Sie zwei Möglichkeiten. Rückrechnen über das Volumen/min Da Sie das genaue Volumen ihrer Probe kennen, können Sie über die Aufnahmezeit am Gerät auf die ursprüngliche Zellzahl zurückrechnen. Nehmen wir an, Sie hatten 10µL Blutprobe und haben die Zellen nach allen Färbe- und Waschschritten in 150µL FACS-Buffer (FB) gelöst. Das Gerät hat einen Probendurchsatz von 10µL/min bei low, 60µL/min bei medium und

3 120µL/min bei high. Wenn Sie jetzt am Durchflusszytometer in einer Minute auf high Leukozyten aufnehmen, wissen Sie also, dass in 120µl Leukozyten waren. Da Sie Ihre Probe in 150µL gelöst haben, hatten sie also insgesamt Leukozyten in Ihrer Probe ( /120*150). Da Ihre ursprüngliche Probe 10µL Blut war, bedeutet das (wenn man die Verluste durch die diversen Waschschritte vernachlässigt), dass Sie µL Leukozyten pro µl Blut haben. Allerdings ist diese Methode relativ ungenau, deshalb werden wir im Praktikum noch eine andere Methode verwenden. Rückrechnen über Standardbeads Sie erhalten von uns Probenröhrchen in die wir eine definierte Anzahl an Latexkügelchen gegeben haben. Zu diesen Standardbeads kommen Ihre Zellen dazu. Alle Färbe- und Waschschritte werden gemeinsam mit den Standardbeads durchgeführt. Wenn wir davon ausgehen, dass Sie bei allen Waschschritten prozentuell gleich viele Standardbeads wie Zellen verlieren, können Sie aus den verbliebenen Standardbeads bei der Auswertung auf die Zellzahlen in der Blutprobe rückrechnen. Wenn Sie z.b. im Probenröhrchen Standardbeads haben und wir finden in unserer Probe am Schluss Standardbeads und Leukozyten, dann wissen wir, dass in der ursprünglichen Probe Leukozyten gewesen sein müssen. IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG Durch Markierung der Zellen mit verschiedenen Fluorochrom-markierten Antikörpern können Sie die unterschiedlichen Zelltypen im Blut unterscheiden (siehe auch CD Antigene, Skript vom Vortag). Hierfür machen wir eine 6-fach Färbung mit denselben Antikörpern, die Sie am Vortrag zur Erstellung der Kompensationssettings verwendet haben. 1. Anti-mouse CD45 PerCP/Cy5.5 Alle Leukozyten 2. Anti-mouse CD4 APC/Cy7 CD4 pos. T Zellen (T Helferzellen) 3. Anti-mouse CD8 FITC CD8 pos. T Zellen (Zytotoxische T Zellen)

4 4. Anti-mouse CD14 APC Monozyten 5. Anti-mouse CD19 PE/Cy7 B Zellen 6. Anti-mouse Siglec F PE eosinophile Granulozyten IHRE AUFGABEN: 1. Installieren Sie die Cyflogic Auswertesoftware auf Ihrem Laptop (Freeware, steht auf PLUSOnline zum Download bereit). 2. Bestimmen Sie die Anzahl der Leukozyten, T-Helferzellen, Zytotoxischen Zellen, B-Zellen, eosinophilen Granulozyten, und der neutrophilen Granulozyten pro µl Blutprobe. 3. Sammeln Sie die Ergebnisse der anderen Gruppen und machen Sie eine statistische Auswertung. Unterscheiden sich die Blutbilder der allergischen Mäuse von denen der nicht-allergischen Mäuse? DURCHFÜHRUNG DES EXPERIMENTS: Färbung der Blutprobe 1. Nehmen sie ein 1.5mL Reaktionsgefäß mit Standardbeads. a. Das Verwenden von Standardbeads erlaubt später die exakte Bestimmung der Zellzahl in der Probe. 2. Pipettieren sie 20µL Vollblut (liegt bereits portioniert auf ihrem Platz) zu den Standardbeads. 3. Pipettieren sie von jedem der 6 Antikörper 4µL zu ihrer Blutprobe. Sie erhalten die einzelnen Antikörper 1:10 vorverdünnt in FB. Wie hoch ist die Endkonzentration der Antikörper in ihrer Probe? 4. Stellen Sie Ihre Probe 10min auf Eis. Die Antikörper binden jetzt an die entsprechenden Oberfächenantigene. 5. Geben sie 500µL FB zu und mischen sie.

5 a. Durch die Zugabe von FB wird das Volumen erhöht um die Probe zu waschen (ungebundene Antikörper werden entfernt). 6. Zentrifugieren Sie 10min bei 3000rpm bei RT. 7. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet mitzunehmen. Der Puffer muss so vollständig wie möglich abgehoben werden, ansonsten funktioniert der anschließende Lysis-Schritt nicht. ABB.1 ÜBERSTAND ABHEBEN. Pipettieren Sie vorsichtig den Überstand ab, ohne das Pellet aufzusaugen. Quelle: 8. Resuspendieren sie das Pellet gründlich in 500µL FACS-Lyse. Diese hypotone Salzlösung lysiert die Erythrozyten. Wenn das Pellet nicht komplett resuspendiert ist funktioniert die Lyse nicht! 9. Inkubieren Sie 10min bei RT. Die Probe sollte bei erfolgreicher Lyse klar werden (-klar als Gegenteil von trüb. Die Probe ist trotzdem rot, da das Hämoglobin aus den lysierten Erythrozyten ja nach wie vor in der Lösung ist.) 10. Geben Sie 500µL FB zu um das FACS-Lyse auszuwaschen. 11. Zentrifugieren Sie 10min bei 3000rpm bei RT. 12. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab. 13. Das Pellet sollte jetzt nicht mehr rot, sondern weiß (und sehr viel kleiner) sein. Wenn Ihr Pellet noch rot ist, war die Lyse nicht vollständig. Wiederholen Sie Schritt Resuspendieren Sie Ihr Pellet in 150µL FACS buffer und überführen Sie die Probe in ein FACS-Tube. 15. Gehen Sie mit Ihrer Probe zum LV-Leiter um sie im FACS zu messen. 16. Speichern Sie ihre Daten auf einen USB Stick.

6 Auswerten ihrer Ergebnisse mit der Cyflogic Software Die Cyflogic Software ist eine Freeware Software mit der Sie FACS Daten analysieren können. Sie können die Software und die Anleitung über PLUSonline herunterladen. Wir gehen nun Schritt für Schritt die Auswertung Ihrer Probe durch. Die im Skript gezeigten Daten stehen auch als Demofile.fcs zum Download bereit. 1. Öffnen Sie die Cyflogic Software und fahren Sie mit dem Mauszeiger an den rechten Rand des Fensters, bis sich ein Panel öffnet. Klicken Sie auf Freeze the panel, damit das Panel dauerhaft eingeblendet bleibt. 2. Gehen Sie auf Files -> Open FCS und machen Sie Ihr File auf. Die Daten werden entweder im Fast draw mode oder im Full draw mode dargestellt. Diese unterscheiden sich nur in der Anzahl der Events, die im Plot gleichzeitig dargestellt werden. Die maximale Anzahl an Events für beide Darstellungsweisen kann man unter Edit einstellen. Durch Anklicken des Plots mit der rechten Maustaste können Sie die

7 Ansicht zwischen Fast draw mode und Full draw mode wechseln. Bis auf weiteres bleiben wir im Full draw mode. 3. Auf den Achsen des neu geöffneten Plots wurde automatisch auf der X-Achse der Foward Scatter (FSC) und auf der Y-Achse der Side Scatter (SSC) aufgetragen. Das A neben FSC und SSC bedeutet Area, d.h. es wurde die Fläche unter der Signalkurve aufgetragen (siehe Tag 2, Abb. 5). Sie können folgende Populationen erkennen (eine Population ist eine mehr oder minder klar begrenzte Ansammlung von Events):

8 a. Standardbeads Das sind die Latexkügelchen, von denen genau Stück in Ihrem Reaktionsgefäß waren. Mit ihrer Hilfe können wir später die absolute Zellzahl bestimmen. b. Debris Hierbei handelt es sich z.b. um Reste von Zellmembranen, die nach der Erythrozytenlyse übrig geblieben sind, tote Zellen oder andere Verunreinigungen. c. Lymphozyten Diese Population umfasst zum Großteil die T Zellen (CD4 und CD8) sowie die B Zellen (CD19). d. Monozyten Diese Population ist oft nicht klar von den Lymphozyten abgegrenzt. e. Neutrophile und eosinophile Granulozyten Wie der Name schon sagt, haben diese Zellen mehr Granula in ihrem Zytoplasma. Deshalb erscheinen sie im SSC höher als z.b. die Lymphozyten. Auch hier sind die Eosinophilen nicht klar von den Neutrophilen abgrenzbar. 4. Obwohl wir hier die wichtigsten Zellpopulationen nur anhand von FSC und SSC erkennen können, ist für eine genaue Analyse die Immunphänotypisierung nötig. Stellen Sie jetzt auf der X-Achse die Anzeige auf PerCP-Cy5.5 um (rechte Maustaste). Sie können auch einfach einen weiteren Plot über Create -> Dotplot aufmachen. 5. Wie Sie sich sicher erinnern können, war mit PerCP-Cy5.5 der anti-cd45 Antikörper markiert. Mit diesem Antikörper wurden also alle Leukozyten gefärbt. Wir werden jetzt 2 verschiedene Regionen definieren. Eine um die Standardbeads und eine um die Leukozyten: a. Wählen Sie dazu eine Farbe im rechten Panel aus, klicken Sie auf Create und zeichnen Sie ein Polygon um die entsprechende Population. Mit Rename können Sie dem Polygon auch einen aussagekräftigen Namen geben (bitte nur ein einzelnes Wort, ohne Abstände, sonst haben wir später beim Gaten Probleme). b. Sie werden bemerken, dass jeder Region eine Farbe zugeteilt wird und diese Farbe in allen anderen Plots ebenfalls verwendet wird. Durch das markieren der Leukozyten mit Hilfe des CD45 Markers (im unteren Plot) können Sie im oberen Plot z.b. erkennen, dass es sich bei der Population im linken unteren Eck um keine Leukozyten handelt (sondern eben um Debris).

9 6. Nachdem Sie jetzt schon die Standardbeads und die gesamten Leukozyten markiert haben, können wir uns jetzt die entsprechenden Zellzahlen anzeigen lassen. a. Durch Anlicken des Plots mit der rechten Maustaste und Anwählen von open statistics wird ein kleines Fenster geöffnet, in dem die Anzahl aller sichtbaren Zellen ( Visible ) angezeigt wird, sowie die Anzahl der Zellen in den markierten Regionen. X mean, Y mean, X-geo mean und Y-geo mean gibt die durchschnittliche Fluoreszenzintensität der entsprechenden Population an,

10 diese ist für uns aber nicht weiter von Bedeutung (Sie können diese Anzeige auch ausblenden). 7. In unserem Beispielfile haben wir also 2119 Standardbeads und Leukozyten. Mit diesen Angaben können Sie berechnen, wieviele Leukozyten pro µl in der Blutprobe waren: a. Im Röhrchen waren Standardbeads und 20µL Blut. Also waren in den 20µL Blut Leukozyten (41032/2119*10000). Pro µl ergibt das 9682

11 Leukozyten. Dies liegt im unteren Normbereich der in Tabelle 1 angegebenen Werte. 8. Für alle weiteren Marker können wir auch andere Methoden wählen, um die Zellzahl zu bestimmen. Diese werden Sie etwas weiter unten im Skriptum kennenlernen. 9. Um die Anzahl der CD4 positiven (T-Helferzellen) und CD8 positiven (Zytotoxische T-Zellen) Zellen zu bestimmen können Sie z.b. auf den jeweiligen Plots CD45 (PerCp-Cy5.5) gegen CD4 (APC-Cy7) bzw. CD8 (FITC) auftragen. a. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Plot und lassen Sie sich nur die Leukozyten anzeigen ( Show populations -> Leukos). Alle anderen Zellen werden dann ausgeblendet. b. Legen Sie neue Regionen um die CD4 bzw. CD8 positiven Zellen an und lassen Sie sich die Zellzahl anzeigen.

12 10. Wir haben in dieser Auswertung also 4976 CD8 positive Zellen (12.12% der Leukozyten) und CD4 positive Zellen (37.35% der Leukozyten). Die % beziehen sich immer auf die sichtbaren Zellen. Da wir vorher alle Zellen außer den Leukozyten ausgeblendet haben, bezieht sich die Angabe also direkt auf die sichtbaren Zellen (d.h. die Leukozyten). a. Berechnen Sie wie oben die Anzahl der CD4 und CD8 Zellen pro µl Blut

13 11. Ist Ihnen aufgefallen, dass im oberen Fenster in der CD8 Region auch einige CD4 positive Zellen sind? Wie kann das sein? a. Wählen wir dazu eine andere Darstellungsform. Zeigen Sie auf der X-Achse die CD4 Zellen und auf der Y-Achse die CD8 Zellen (beachten Sie, dass die Farben der Regionen aus den anderen Plots, selbst wenn diese nicht aktiv sind, weiterhin beibehalten werden!) b. Klicken Sie auf Show Quadrant und unterteilen Sie das Fenster in 4 Quadranten.

14 12. Sie sehen, dass es nicht nur CD8 positive (upper left) und CD4 positive (lower right) Zellen gibt, sondern auch eine kleine Population an doppelt positiven Zellen (upper right) gibt. Dabei handelt es sich um sogenannte extrathymische T-Zellen, eine geringe Anzahl an doppelt positiven T-Zellen, die der positiven thymischen Selektion entschlüpft sind (Das sei hier aber nur am Rande erwähnt). Die Anzahl dieser Zellen ist jedoch so klein, dass sie unsere oben durchgeführte Auswertung nicht entscheidend verfälschen. Sie können jedoch für Ihre Auswertung auch die Zahlen der mittels Quadranten erstellten Statistik verwenden und die extrathymischen T-Zellen in ihrem Blutbild mit angeben. 13. Um die Anzahl der eosinophilen Granuloyzyten zu bestimmen, tragen Sie CD45 gegen Siglec-F (PE) auf. a. Bestimmen Sie die Anzahl der Eosinophilen / µl Blut.

15 14. Neben der Population an Eosinophilen sieht man eine sehr kleine Population an Zellen, die Siglec-F positiv sind, aber auch CD45 stärker exprimieren (daher weiter rechts stehen). Hierbei handelt es sich möglicherweise um unreife Zellen der myelomonozytischen Linie, die auch dafür bekannt sind, Siglec-F zu exprimieren. Für unsere Auswertung spielen sie keine Rolle. 15. Um die restlichen Zelltypen zu bestimmen, tragen Sie jeweils CD19 (PE-Cy7, B Zellen) und CD14 (APC, Monozyten) gegen CD45 auf.

16 16. Wie Sie sehen, lassen sich die B-Zellen (oben) und die Monozyten (unten) nicht so klar von den anderen Zellen abgrenzen, wie die bisherigen Zellpopulationen. a. Um diese Population etwas besser markieren zu können, macht es Sinn, erst einmal alle anderen Zellpopulationen, die wir schon bestimmt haben, auszublenden. b. Dazu definieren wir ein sogenanntes Gate.

17 c. Wählen sie eine Farbe unter Definitions im rechten Panel und klicken sie auf Define. d. Wie wollen alle Leukozyten, außer CD4, CD8, oder Eos sehen. Daher geben Sie Folgendes ein: Leukos and not CD4 and not CD8 and not Eos e. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Plots und lassen Sie sich nur die so definierten Zellen anzeigen. Sie sehen, jetzt wird das Ganze schon etwas übersichtlicher und wir können leichter die CD19 positiven B-Zellen und die CD14 positiven Monozyten markieren. f. Bestimmen Sie die Anzahl der CD19 und der CD14 positiven Zellen pro µl Blut.

18 17. Eine Zellpopulation haben wir noch vergessen: die neutrophilen Granulozyten. Da wir keine eigene Färbung für die Neutrophilen durchgeführt haben, können wir sie nur indirekt nachweisen. a. Wie Sie unter Punkt 2 gesehen haben, kann man die Neutrophilen schon recht gut im FSC/SSC Diagramm erkennen. b. Eine ziemlich genaue Bestimmung bekommen wir, wenn wir wieder alle anderen Zellpopulationen, die wir schon definiert haben, ausblenden.

19 c. Also definieren wir ein Gate wie folgt: Leukos and not CD4 and not CD8 and not CD14 and not CD19 and not Eos. d. Diese Zellen lassen wir uns im FSC/SSC Diagramm anzeigen und markieren dann die (jetzt gut abgegrenzten)neutrophilen. e. Berechnen Sie die Anzahl der Neutrophilen / µl Blut. 18. Fällt Ihnen etwas auf? Obwohl wir alle anderen Zelltypen ausgeblendet haben, sind immer noch einige andere Zellen übrig (im Bereich der Lymphozyten und Monozyten).

20 Das sind zum Teil Zellen, die wir beim Einzeichnen unserer Regionen nicht erwischt haben und zum Teil andere Zellarten, die keine der von uns verwendeten Marker exprimieren (z.b. NK Zellen, etc.). 19. Sie sollten jetzt folgende Daten für das Blutbild ihrer Maus haben (vervollständigen Sie die Tabelle): Zelltyp Gesamt Leukozyten CD4 + Zellen (T-Helferzellen) CD8 + Zellen (Zytotoxische T-Zellen) CD14 + Zellen (Monozyten) CD19 + Zellen (B-Zellen) Siglec F pos. Zellen (Eosinophile) Neutrophile Zellen pro µl Blut Statistische Auswertung der Ergebnisse Sie erinnern sich an unsere ursprüngliche Fragestellung: Wir wollten wissen, ob sich das Blutbild einer allergischen Maus von dem einer naiven Maus unterscheidet. Dazu müssen wir die Daten von allen Gruppen gemeinsam statistisch auswerten. 4 Gruppen hatten jeweils eine sensibilisierte Maus und 4 Gruppen hatten jeweils eine naive Maus. 1. Besorgen Sie sich die Ergebnisse der anderen Gruppen 2. Kopieren Sie die Daten in Excel (Microsoft) oder Calc (Open Office). Ein Template liegt zum Download bereit. 3. Nutzen sie das Template, um für alle Zellarten ein Diagramm zu erstellen und zu berechnen, ob sich die Gruppen signifikant voneinander unterscheiden. Dazu verwenden wir einen two-tailed unpaired T-Test. Ein hypothetisches Beispiel sehen sie unten in der Grafik. 4. Bereiten sie für die Abschlussbesprechung eine Powerpoint-Präsentation vor.

21 MATERIAL-LISTE: GERÄTE: Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200, 20 und 10µL. 1.5mL Reaktionsgefäße 1.5mL Reaktionsgefäße mit Standardbeads Heparinisiertes Mausblut

22 Verdünnte Antikörperlösungen (Anti-mouse CD4 APC/Cy7, Anti-mouse CD8 FITC, Anti-mouse CD14 APC, Anti-mouse CD19 PE/Cy7, Anti-mouse CD45, PerCp/Cy5.5, Anti-mouse Siglec-F PE) jeweils 1:10 in FACS-Buffer Zentrifuge FACS Canto II Durchflusszytometer LÖSUNGEN: FACS Buffer 1% BSA, 2mM EDTA in PBS