Warum Einzelmolekülexperimente? Moleküle sehen: Optische Experimente Moleküle manipulieren: Strecken, knoten, ziehen molekulare Maschinen

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1 Experimente mit einzelnen Biomolekülen Techniken, Möglichkeiten und Erkenntnisse von biophysikalischen Einzelmoleküluntersuchungen - ein Überblick Warum Einzelmolekülexperimente? Moleküle sehen: Optische Experimente Moleküle manipulieren: Strecken, knoten, ziehen molekulare Maschinen Bilder, ausgew. Literatur und ergänzendes Material auf der WEB-Seite des Inst. für Med. Physik undbiophysik

2 Mittelwert und Mikrozustände Molekülensemble Verteilungsfunktion Häufigkeit Experiment Eigenschaft Mittelwert repräsentativ Mittelwert = Ensemble-Mittelwert: Mikrozustände Häufigkeit! gemessene Eigenschaft M = Zahl der Mikrozustände Ensemble i Ensemble P M P i i Häufigkeit Eigenschaft Mittelwert nicht repräsentativ

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4 molekulare Prozesse und Maschinen

5 Gründe für Einzelmolekülexperimente viele Biomoleküle sind Individuen Verteilungsfunktion wesentlich informativer als Mittelwert ( kleine Moleküle in komplexer Mikroumgebung; große Moleküle mit komplexen Konformationsumwandlungen) Prozesse (z.b. chem. Reaktionen) können digital (an/ aus) verfolgt werden, keine Synchronisation nötig unerwartete Effekte (neue Techniken, versteckte Zustände) emotionaler Bezug: der Phys-/Chemiker denkt (meist) einzelmolekular

6 Probleme bei Einzelmolekülexperimenten - Größe ( Kleinheit ) des Objekts - Kontrast vor Hintergrund - biologisch-relevante Bedingungen: wässrige Umgebung, Zimmertemperatur, fluide Phasen

7 Dimensionen von Biomolekülen 1 nm=10-9 m nm 4-6 nm Wasser Lipidmembran Filamente 2-5 nm DNA 5-50 nm 1000 nm > Protein

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9 Fluoreszenzmarkierung Flureszenzmarkierung (-Label, -Sonde) Fluoreszein Biomolekül (Protein, DNA, Lipid) Rhodamin

10 Fluoreszenz: Spektrum Stokes-Shift Intensität Absorption Fluoreszenz λ A < λ F Wellenlänge z.b.: blaues Anregungslicht erzeugt grünes Fluoreszenzlicht

11 fluoreszeierende Moleküle sehen: Prinzip Anregunslaser Fluoreszenz PSF=point spread function 100 nm << λ F nm

12 fluoreszeierende Moleküle sehen: Ortsauflösung 4.5x4.5 µm Abbild eines Polymergels (Polyacrylamid) mit verteilten, fixierten Fluorophoren FWHM der Intensitätspeaks 100 nm Position von Molekülen kann mit Genauigkeit von nm bestimmt werden

13 Bewegung fluoreszenz-gelabelter Lipide Lipidmembran mit abnehmendem Anteil gelabelter Lipide 6.8 µm counts per 5ms ms Beobachtung von 2 Lipiden als Funktion der Zeit Trajektorien liefern mittleres Verschiebungsquadrat, r 2 = x 2 + y 2, als Funktion der Zeit, t Diffusionskonstante D lat = r 2 /4t= cm 2 /s 70 ms x r y r 2 / µm 2 t / ms

14 Imaging von 3D-Molekülorientierungen Richtungsabhängigkeit der Intensität des Fluoreszenzlichtes θ µ 2 I F sin θ

15 Fluorezenzblinken: Molekülrotationen Detektion Intensität an aus Zeit, s θ = 0 90 Intensität Polarisator I x intensität I y I x Zeit, s ψ= 0 90 I y

16 Fluoreszenz-Blinken fluoreszeierendes Protein (green fluorescent protein GFP) y s Blinken einzelner, unterschiedlich orientierter GFP- Moleküle x ψ µ y ψ x

17 Kinetik der GFP-Fluorezenz Counts per 0.8 ms y µ Umorientierung um 45 I x, I y x I x + I y an aus Zeit / ms

18 Fluoreszenzkinetik des Einzelmoleküls Anregungsrate pro Molekül bei kontinuierlicher Bestrahlung: k ex = σ ρ p 10 8 s -1 ca. alle 10 ns (Photonendichte: ρ p =10 24 cm -2 s -1, Absorptionsquerschnitt: σ=10-16 cm 2 molek -1 ) Deaktivierungsrate: k em = k F + k N 10 9 s -1 ca. alle 1 ns 10 ns=10-8 s Fluoreszenz (k F ); strahlungslos (k N ) registrierte Photonen S 1 Zeit (50 ns) angeregter Zustand S 0 Grundzustand

19 gezählte Photonen 10 ns=10-8 s t=50 ns counts 4 5 µs intensität aus an Fluoreszenzblinken ms Photonenschauer (burst)

20 Datenanalyse: Zwei-Zustandsmodell intensität an aus Zeit, s Schema an Z.B. Singulett-Zustand k off k on aus z.b. Triplett-Zustand Wahrscheinlichkeit, daß nach Anregung bei t=0 der Zustand an zum Zeitpunkt t noch vorliegt dp (t) on dt = k P (t) P (t) = exp( k t) off on on off

21 Datenanalyse: Histogramme intensität an Wahrscheinlichkeit, P on (t) aus P on (t): Normierte Häufigkeit des Auftretens von t on =t P (t) on = N on (t = ton) N exp(-k off t) on t on Wahrscheinlichkeit, P off (t) Zeit, s P off (t): Normierte Häufigkeit des Auftretens von t off =t exp(-k on t) t off

22 Fluorezenzblinken: chemische Reaktionen Flavoenzym: Cholesterol Oxidase k off E-FAD E-FADH 2 k on an E-FAD aus E-FADH 2 k off =4 s -1

23 Fluorezenzblinken: translatorische Diffusion 2D 3D Anregunslaser Fluoreszenz intensität an drin draußen aus Zeit, s

24 Fluorezenzkorrelationsspektroskopie: FCS an aus G(t) exp(-k on t) k on =4πR c c D 2R c

25 Zwei Fluorophore: RNA Faltungskinetik RNA grün Protein S15 Modelliert Elementarschritt der Proteinsynthese an Ribosomen Fixierung rot Image: RNA und RNA+S15 Anteil rot, I rot /(I rot +I grün )

26 Fluorezenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) Dipol-Dipol-WW R -6 R D* A Spektrum D A* k FRET Übertragung der Anregungsenergie Anregung FRET Intensität Donor λ ex D λ D λ ex A Akzeptor λ A Wellenlänge

27 FRET: Ortsauflösung im sub-nm Bereich Anteil der Anregungsenergie, die transferiert wird: FRET-Effizienz k R = + FRET E= 1 k D+kFRET R0 6 1 k D : Deaktivierungsrate ohne FRET k FRET : FRET-Rate Förster-Abstand: R nm (R 0 ist Funktion der spektralen Überlappung und gegenseitigen Orientierung von D und A) Effizienz aus an an D R 0 A R / nm aus A D

28 Single pair FRET (spfret): Kinetik D A aus aus an an an R 0 k off R 0 aus k on Fl.-Intensität: I D, I A FRET-Effizienz: E= I A / (I D + I A ) FRET an aus Zeit

29 Single pair (spfret): Ribozyme Faltungskinetik R 0 RNA-Sekundärstruktur (ca. 400 Nukleotidbasen) katalysiert Spaltung des Substrates (Oligonukleotid) D S FRET-Effizienz: E= I A / (I D + I A ) an aus A aus k off k on Fixierung an Fl.-Intensität: I D, I A

30 spfret: Abstandsverteilung und Energielandschaft FRET-Effizienz: E= I A / (I D + I A ) FRET-Abstand: R ➋ Häufigkeit: P(R) ➍ ➊ ➋ ➌ FRET-Abstand: R ➍ ➊ ➌ Zeit aus Effizienz P(R)=exp(- G/kT) G (R) ➊ A ➋ an au s an aus ➍ R / nm ➌ Freie Energie: G(R) ➊ ➋ ➌ FRET-Abstand: R ➍

31 Zusammenfassung: FRET spfret: Intramolekulare Abstandsänderungen mit sub-nm Auflösung, Faltungskinetiken Energielandschaft komplexer Biomoleküle

32 Moleküle anfassen und strecken: Atomic Force Mikroskopie x Streckung eines modularen Proteins F k bekannt L L Hooksches Gesetz: F = - k x

33 Modulare Moleküle strecken F Kontakt reißt Beiträge zu F: F 2. Modul streckt P. gespannt 1. Modul streckt P. gespannt entropische Kraft (Streckung eines Knäuls) spezifische WW (z.b. H- Bindungen) L adhäsiver Kontakt Abweichung von Hookschen Gesetz: F L F ➊ ➋ Theorie ➌ ➍

34 Bakteriorhodopsin aus einer Membran ziehen 7 Transmembran-Helizes Loop ➍ ➌ ➋ ➊ Membran ➊ Protonenpumpe Bakteriorhodopsin ➋ ➌ AFM-Bild der Purpurmembran Loch 200 ➍ pn 20 nm 80

35 optische Pinzette Prinzip dielektrisches Kügelchen (Radius 1µm > Wellenlänge 0.5µm) z.b. Polysteren, Silizium x F k x [10-12 N=pN] fokussierter Laserstrahl

36 Moleküle knoten und zerreißen Laser- Fokus optische Doppel -Pinzette (fluoreszenzmarkiert) Polysteren- Kügelchen Aktin- Filament F fest DNA, Aktin beweglich 10µm (Piezo-Steller, Defokussierung) Biegesteifigkeit: N/m 2 F02

37 molekulare Kopiermaschine: RNA-Polymerase 2 µm RNAP krabbelt entlang der DNA ➊ Anfang suchen ➋ lesen und kopieren ➌ beenden D01

38 RNA-Polymerase: schnell oder stark? RNA wird synthetisiert RNAP DNA Unterlage optische Pinzette

39 RNA-Polymerase: schnell oder stark? RNA Bewegung Bewegung Bewegung Bewegung Kraft Kraft Kraft Kraft RNAP x x x x

40 RNA-Polymerase: schnell oder stark? L x=const F Bewegung RNAP Kraft Kraft-Geschwindigkeits-Charakteristik F V=dL / dt ➊ ➋ F L Transkriptions pausen v Motor abgewürgt ➋ v=const

41 molekulare Kraft-Bewegungs-Maschinen 10 nm elektronenmikroskopische Aufnahme: Dynein Transporter Traktor Turbine

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43 molekulare Kraft-Bewegungs-Maschinen translatorische Bewegung chemische Energie (ATP) Rotation Kinesin Bio-Abgas (ADP+P)...regenerierbar Filament ( Autobahn ) ATPase

44 Kinesin: force-clamp-experimente Meßprinzip der Kraft-Klammer : L x Kügelchen Fokus L=8nm 1. Kinesin krabbelt entlang der m.-tubule und zieht den bead aus dem Fokus um x 2. Der Fokus ( trap ) wird nachgeführt um x 0.2nm im Mittel konstant zu halten 3. Der Motor arbeitet unter Last : F=k x (k=0.04 pn/nm) 4. Die Kraft F wird mit der Geschwindigkeit der Bewegung, v=dl/dt, korreliert x F

45 Kinesin hat den schwächeren Motor Kraft-Geschwindigkeits-Charakteristik bei unterschiedlicher Treibstoff - Verfügbarkeit (ATP-Konzentration) RNA-Polymerase F v=var v=const

46 Ausblick: mechanische Manipulation mit optischer Detektion opt. Pinzette + spfret AFM + spfret

47 Neu: durch die AFM-Spitze schauen und fühlen Anregung AFM opt. Rasterbild Fluoreszenz 4 µm FRET

48 Hausaufgabe : ergänzendes Material Grundlagen: Fluoreszenz, Energieniveaus, FCS (Korrelationsfunktion), opt. Pinzette exp. Details: Probenbeleuchtung, Ortsauflösung bei zweifarbiger Detektion, mech. Manipulatoren Beispiele: spfret: Denaturierung von Chemotrypsin, Elastizität von DNA, DNA-Polymerase, Myosin, molekulare Turbinen (ATP-Synthetase)

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