Molekulare Erkennung Einzelnen Molekülen auf den Zahn gefühlt

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1 National Center of Competence in Research Nanoscale Science Molekulare Erkennung / IfP Dynamische Kraft Spektroskopie ptische Pinzetten Molekulare Erkennung Einzelnen Molekülen auf den Zahn gefühlt 1 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner PD Dr. Martin Hegner NCCR Nanoscale Science Institut für Physik Universität Basel Klingelbergstrasse 82 CH-4052 Basel Vorlesung zu finden auf: monet.physik.unibas.ch/~hegner/molrec.pdf AFM Federbalken Tip Ligand/Rezeptor Interaktionen Protein Faltung Ligand Rezeptor Federbalken Arrays AFM Federbalken 2 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner AFM Federbalken bead fluid chamber micropipette Ziel dieser Vorlesung Biophysik mit einzelnen Molekülen 1. Was für Fragestellungen beschäftigen uns? Physik Chemie 2. Wie können wir die Probleme untersuchen? Nanoscience 3. Was können wir daraus lernen? Biologie 3 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 4 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

2 Übersicht Was bedeutet molekulare Erkennung? Molekulare Erkennung Dimensionen und Kräfte Moleküle und Grenzflächen berflächen Funktionalisierung Dynamische Kraft Spektroskopie ptische Pinzetten Einzel Molekül Anwendungen Federbalken Array Unspezifische Erkennung Spezifische Erkennung 5 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 6 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Was bedeutet molekulare Erkennung? Wie interagieren Moleküle? Ionische Kräfte z.b. Amino Säuren mit Resten I R-NH 3+ <-> R-C - Typ. Energie in Wasser 4-7 kcal/mol (6-12 k B T) Eukaryontische Zelle 7 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner III II Signale auf die eine Zelle reagiert Wasserstoff Brücken z.b. DNA Teilen eines H Atoms zwischen zwei Molekülen die elektro-negative Atome tragen (meistens N und ) Starke Dipol-Dipol Interaktion mit gerichtetem Charakter Typ. Enegie in Wasser: 3-6 kcal/mol (5-10 k B T) Van der Waals Kräfte Schwache, lang-reichweitige Interaktion zwischen nicht-polaren Molekülen Typ. Energie in Wasser 1 kcal/mol ( 2 k B T) 8 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

3 Wie gross ist ein einzelnes Biomolekül? Cro Protein-DNA Interaktion (molekulare Erkennung einer DNA Sequenz) Menschliches Haar Durchmesser ~20 µm DNA-Protein Komplexe DNA Durchmesser 2 nm 9 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 10 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Abbilden von Nucleo- / Protein Komplexen R c Tip R c W 2R m Wo wirken Kräfte in Pico-Newton? 1 nm 3 Wasser (33 Moleküle) erfahren eine Gewichtskraft von F G =10-23 N = pn Die Kraft, die der stärkste bio-molekulare Motor generieren kann beträgt ~ 60 pn Plasmid DNA geschnitten mit Restriktions Enzym HindIII 11 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Protein filament (Titin) Die Kraft, die zu einer chemischen Bindung führt, kann man ableiten als: F chem = 1 ev / 0.1 nm = 1600 pn 12 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Na Cl

4 Wie misst man Pico-Newton? Instrumente Kraftmikroskopie Federbalken Spitze In Lösung Positions detektor 13 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner ptische Pinzetten Der Kraft-Sensor ist eine kleine Plastik Kugel, die mit Licht festgehalten wird µm Moleküle an Grenzflächen Motivation: Abbilden einzelner Biomoleküle und Messen von kleinen Kräften zwischen Molekülen in einer natürlichen Umgebung (Lösung) ist möglich, wenn man Raster-Kraft Mikroskopie oder ptische Pinzetten benützt. Was berücksichtigt werden muss: Beeinflusst die Deposition eines Moleküls auf einer berfläche die biologische Funktion? Die berflächen müssen bio-kompatibel sein Eine Methode für die spezifische Verankerung muss entwickelt werden 14 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Chemische Aktivierung einer berfläche berflächen Aktivierung Interketten Interaktionen (van der Waals, Elektrostatisch) ω -funktionalisierte Interface Gruppe berflächenaktive Kopfgruppe Substrat X X X X Si, Ta 2 5, Au, Pt X X X X X Θ~30 15 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Si Si Si Si Si Si Si Si S S S S S Monolayer mit einem kovalenten Polysiloxane Netzwerk resultierend aus Silanisierung einer Glas berfläche mit einem ω-funktionalisiertem rganosilan. 16 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. Arrangement M. Hegner Au(111) Chemisorption eines ω- funktionalisierten Alkanthiols auf Au(111), führt zu einem dicht-gepackten Monolayer STM Bild eines SAM

5 Synthese eines SAM Moleküls DMU DMU N H HS S S ph Br H 1 S S S H 2 I2 S S H 3 NHS/DCC oder MAL/DCC N DSU Messung der Interaktionen Motivation Ist es möglich einzelne Interaktionen von Biomolekülen zu detektieren? Können wir die Kraft einer einzelnen biomolekularen Bindung quantifizieren? Besteht ein Zusammenhang zwischen den gemessenen Einzel-Molekül Kraft Messungen und den thermodynamischen Daten? Wagner et al. Biophys. J. 70 (1996) 2052 Hegner et al. J. Vac. Sci. Technol. B 14 (1996) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner S DSU auf Gold MH, IfP Uni Basel Ist es möglich neue Biosensoren basierend auf dem Einzelmolekül Experiment zu entwickeln? 18 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Ensemble Messungen Einzel-Mole Molekül l Experimente Ensemble Messungen Einzel-Mole Molekül l Experimente Ensemble Individuum Ensemble Experimente: e.g. nm Konzentration (0, M) Messung von Moleküle / Zeit Gemittelte Eigenschaften der Parameter werden gemessen Einzel-Molekül Experimente: Messung an einem Molekül / Zeit Mehr als eine Mesung ist nötig um Einblick in die Untersuchten Eigenschaften zu ermöglichen (Statistik) Zugang zu Eigenschaften welche im gemittelten Resultat untergehen 19 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 20 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

6 Mechanik + Kinetik Raster Kraft Mikroskop Zell Adhesion F A Detektor B Laser Quelle AFM F Dissoziations Konstante AB A + B K Diss = [A]*[B]/[A*B] Affinität: Chemische Anziehung; Biomolekulare Interaktion die eine Spezifität zeigt Piezo Bewegung Z X Y A-B Spitze berfläche Kraft Bewegung Ablenkung 21 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 22 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Dynamische Kraft Spektroskopie Dynamische Kraft Spektroskopie (Kraft Auflösung > 10 pn) Motivation: Ist es möglich einen Einblick in die Bindungs-Eigenschaften einer einzelnen bio-molekularen Bindung zu gewinnen? Hat das Experiment, das an einem Molekül gemessen wird einen Bezug zu den Daten die wir am Ensemble messen? 23 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Force 50 pn 50 nm Piezo Position Einzel-Molekül Experimente korrelieren direkt mit thermodynamischen Experimenten ( G; H; S) 24 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

7 Dynamische Kraft Spektroskopie Ziehen eines einzelnen Moleküls mit variierenden Geschwindigkeiten Energie Zeit die benötigt wird bis sich eine Bindung löst (Bell, Science 1978) x τ off F x=w Reaktions-Koordinate G W ( W ) = τ D exp kbt Keine spezifische Stärke einer Interaktion τ off reduziert auf Sekunden wenn externe Kraft angelegt wird Dynamische Kraft Spektroskopie Wahrscheinlichste Kaft F* für Bindungs-Dissoziation (Evans and Ritchie, Biophys. J. 1997) F* τ off k B T = x F 0 lnr (Beladungs-Rate) - keine spezifische Kraft für die Dissoziation! - DFS misst makroskopische und mikroskopische Parameter 25 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 26 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Ist die gemessene Interaktion spezifisch? Wahrscheinlichkeit Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Kraft (pn) spezifisch unspezifisch Spezifische Verankerung der Moleküle auf berflächen Wagner et al. Biophys. J. 70 (1996) 2052 Hegner et al. PNAS 96 (1999) Biomolekül Bioreaktive Gruppe Spacer Funktionalität Substrat Lebenszeit einer einzelnen Bindung Eine Bindung die man aufheizt hält weniger lang Lebensdauer log τ(0) [s] TJ DFM TATTAATATCAAGTTG 3,0 3,1 3,2 3,3 3,4 3,5 3,6 3,7 1/T x 10 3 [ K -1 ] G = H - T S Schumakovitch et al. Biophys. J. 82 (2002) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Steigung des linearen Fit : H TJ ~ 375 (±16) kj/mol DFM ~ 300 (±42) kj/mol

8 ptische Pinzette Flüssigkeits-Kammer Spektrum des Lichts Ungefähre Wellenlänge (in Vakuum) und Frequenz Bereiche für die verschiedenen Farben Sichtbares Licht Region des Electromagnetischen Spektrums Infrarot Farbe Wellenlänge (nm) Frequenz (THz) 0.7µm Rot µm Laser 830 nm BJ Einzelnes Molekül resp. Rezeptor/Ligand BJ range Gelb Grün Blau Violett µm 0.4µm Mikropipette 1 terahertz (THz) = 10 3 GHz = 10 6 MHz = Hz, Ultraviolett 1 nm = 10-3 µm = 10-6 mm = 10-9 m. Das weisse licht ist eine Mischung aller Farben des sichtbaren Spektrums. 29 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 30 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Warum können wir Partikel mit Licht festhalten? Doppel Strahl Laser Pinzette A B Strahl Intensität Linse Reflektiert Reflektiert netto Kraft Strahl Achse θ Netto Kraft A) Ein Licht brechendes Kügelchen wird in das intensivere Zentrum des Strahls gezogen, wird aber vom Licht von der Lichtquelle weg bewegt. (B) Ein konvergierender Laserstrahl, fokusiert durch ein Linse, hält ein Kügelchen in einer konstanten axialen Position White light spatial filter psd pbs diode laser Faraday isolator L1 0.1 atten. obj pbs qwp x-y-z transl. flow chamber obj x-y-z transl. diode laser Faraday isolator qwp pbs psd L1 pbs 0.1 atten. blue filter ccd camera Mikroskop Linse mit Grosser Nummerischer Appertur 31 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Grange W. et al. Rev. Sci. Instr. 73 (2002) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

9 A D A A A Manipulation von Mikro Kugeln mit optischen Pinzetten Experimente mit optischer Pinzette Ziehen eines einzelnen DNA Moleküls Kugel in 3D beweglicher Trap Kugel Plazierung auf Pipette und in 1 er Trap Protein mit Affinität zu DNA fixiert in 3D beweglich in 3D Kugel in der Doppel-Trap 2µm Molekül Pipette beweglich in 3D Kugel gehalten mit Saugkraft auf beweglicher Pipette 3 µm 33 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Geeignet für Experimente mit Einzel-Molekülen, Mechanik und Motor Proteine DNA Molekül ist an den Enden an die berfläche der Polystyrol Kugel gekuppelt Bewegliche Pipette Kugel Durchmesser ~2 µm Husale S. et al. Single Mol. 3 (2002) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Strahl Steuerung Kippen der optischen Ebene innerhalb der Rück-Appertur Bewegen des ganzen Strahls innerhalb der Rück-Appertur Laufende Entwicklungen am Instrument Motivation: Biosensor mit sub pn Sensitivität für biologische Untersuchungen an einzelnen Molekülen in Puffer Lösungen ptischer Weg des Instruments erlaubt Kombination mit Licht Spektroskopie Simultane Einzel-Molekül Mechanik und Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) gemessen mit optischen Pinzetten Exitation Exitation D F Emission Kein Verlust von Licht (Energie) innerhalb der Falle Verlust von Licht (Energie) innerhalb der Falle, asymmetrisches trapping 35 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Inter oder intra Protein Rearrangierung nach Ligand Interaktion innerhalb Filament Protein-Komplexes (Aktin; Intermediäre Filamente, Transport durch NPC, ) 36 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Emission

10 Jedem Gerät seinen Aufgabenbereich Mechanische Eigenschaften von dsdna Elastizität von einzelnen DNA Fragmenten Raster Kraft Mikroskop ( F ~ 10 pn) Molekulare Erkennung Mechanische Deformation Auffalten von einzelnen Molekülen 37 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner ptische Pinzetten ( F ~ 200 fn) Mechanische Eigenschaften Molekulare Motoren Auffalten von einzelnen Molekülen ptische Spektroskopie Kraft [pn] extensible WLC inextensible worm like chain (WLC) elastischer Modulus von B-DNA S-DNA Übergang Ausdehnung [µm] 38 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner ssdna extensible WLC Inextensibles worm like chain Modell: FA k T B = x + 1 ( 1 x ) 2 1 L 4 L 4 A: Molekül Persistenz Länge L: Kontur Länge 2 1/3 * k TS B F = 1 4 A S: Stretch modulus Kleine Moleküle die an die DNA binden, verändern ihre mechanische Eigenschaft grundlegend DNA Kupplung an Polystyrol Kugeln CH modifiziert NH 2 modifiziert Kenntnisse von berflächen und Chemie NH 2 HS 9931 bp bp Biotin Biotin 39 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner EDC S-NHS S-SMCC Hegner, M. Single Mol. 1 (2000) 139 b b b b DNA modifiziert b b DNA modifiziert Kraft [pn] Mechanische Eigenschaften von Protein Nuklein-Säuren Komplexen Kraft Auslenkung Graph von ssdna-reca Filament ds DNA ss DNA Auslenkung [µm] * ssdna-reca Filament RecA Filament: Nano Feder mit molekularem Griff P Hegner, M., Smith, S. & Bustamante, C. Proc. Natl. Acad.Sci.USA96 (1999) 10109

11 Molekulare Motoren (z.b.( Kinesin) Der stärkste bekannte Bio-Motor (Bacteriophage DNA packaging Motor) Kraft ~ 4 pn R. Milligan, Scripps Institute, 41 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 42 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner DNA packaging motor Tans, S. et al. Nature 2001 Zusammenfassung Techniken AFM Biomembran Mikropipette ptische Pinzetten Magnetische Kugeln Kraft [pn] Kraft-Regime Beispiele Molekulare Motoren Polymer Deformation Pagen Motor RNAP DNAP Myosin Kinesin Polymer Elastizität Dextran Heparin Amylose ssdna/dsdna/peg Konformationelle Faltung Raten Abhängig! Protein / RNA Kovalente Bindungen Dissoziations Kräfte raten Abhängig! Si-C Au-S Antigen-Antikörper Biotin-(Strept)-avidin ssdna-ssdna 43 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 44 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

12 (Bio-) ) Chemische Sensoren Sensor Schicht Immobilisierte Rezeptoren Analyte Polymer Schicht Molekulare Erkennung Affinität 45 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Transducer optical electrical magnetical thermal chemical mechanical Bindung konvertiert in Signal Rekorder Signal Verstärkung und Auslesen mit PC Federbalken Arrays Motivation: Biomolekulare Detektion mittels Federbalken Arrays Brauchbar für Genomics (SNPs), Proteomics? Echt Zeit Detektion am Spital Bett? Minimum von 2 Federbalken auf einem Chip 46 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner cantilever array Mikro fabriziert (skalierbar), schnelle Antwort, autonom Nächste Generation Bio-Sensor? Gene-Chip von Affymetrix Federbalken Array Sensor Aufbau ~4000 sfr. / chip Probe Moleküle müssen markiert sein 47 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 48 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

13 DNA Hybridisation gemessen mit Federbalken Arrays Federbalken array Sensor funktionalisiert mit verschiedenen 12 mer ligonukleotiden Detektion von Zielsubstanz in Überschuss von junk Molekülen Injektion von komplementären 12 mer ligonukleotiden Bio B1C in die Flüssigkeits- Zelle ergibt ev. Hybridisation Der korrespondierende Federbalken Bio B1 verbiegt sich und ein Ablenkung-Signal wird messbar Injektion von Mittel das die Interaktion löst (e.g. H 2 pur) löst die Bindung und der Federbalken bieg sich zurück Injektion von Bio B2C biegt den Federbalken Bio B2 McKendry et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99 (2002) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 50 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Injektion von 250 nm B1C und 20 µm B7C Cardiovaskuläre re Applikation Schnelle (mobile) Diagnose am Spitalbett für Intensiv- Station Patienten Diagnose mittels Federbalken Arrays Herz Infarkt Symptome: Brust Schmerzen, Schwierigkeiten beim Atmen Mögliche Diagnose: Abnormitäten im ECG, Blut Test (Biomarker Expression), etc. Biomarker Detektion: Ausschüttung von Creatine Kinase, Troponin, Myoglobin ~ 1-2 Std. nach der Beschädigung der Herz Muskulatur (tote Muskel Zellen) Konzentration indiziert Ausmass des Herz Infarkts Verschiedene Parameter (Herz Schlag Rate, ECG, Atmung,...) werden online überwacht mit verschiedenen Instrumenten in der Intensiv Station. Heutige Test werden mittels ELISA durchgeführt (enzyme linked immuno sorbent assay) Ein Federbalken array Gerät würde eine online Überwachung ermöglichen. Labor Test würde entfallen. Y. Arntz et al. Nanotechnology 14 (2003) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 52 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

14 Proteomics mittels Federbalken Arrays? Funktionalisierung des Federbalkens Mikro-Kapillare Mehrere Schritte für Funktionalisierung einzelner Federbalken Antikörper Crosslinker 20nm Au 2nm Ti Si Silanisierung NHS PEG 53 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Ablenkungs Mechanismus Ablenkung resultiert aus Stress induziert durch die Interaktion des Analyts mit der sensitiven Schicht Mehrfach Antikörper Federbalken Array Differentielle Ablenkung [nm] Zeit [s] 54 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Buffer Myo pro Buffer CK pro Buffer Schnelle Diagnostik? Myoglobin 50 µg/ml Creatine Kinase 50 µg/ml Hintergrund 100 µg/ml BSA Federbalken - Schlussfolgerungen Wir können DNA und Proteine detektieren, die spezifisch an die Federbalken berfläche binden. Die Interaktion bewirkt eine mechanische Ablenkung der Federbalken. Die Ablenkung ist proportional zu der Menge Moleküle die wir einspritzen. Ein differentielles Auslesen des Signals ist nötig Statischer Modus (berflächen Stress): Verbiegen des Federbalken Asymmetrisches Funktionalisierung notwendig dicht gepackter Bio-Moleküle Monolayer notwendig Dynamischer Modus: Eine Massenzunahme wird detektiert Frequenz/Phasen Verschiebung der resonanz Frequenz Federbalken Bio-Sensoren werden wichtige Sensoren für die Bio-Diagnostik 55 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Top Nano 21 Programm: Funktionalisierte Federbalken Arrays xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx Cantilever K + Modul 1: SAM und Plasma Deposition Modul 2: Protein Federbalken Array Modul 3: Schnelle Mikroorganismen Detektion Modul 4: Verstärkung mit Dendrimeren 56 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Leitung M. Hegner Start 9/02 Ibuprofin Modul 5: Enantio spezifische Detektion Modul 6: Beschichtungs- Prozeduren Modul 7: Molekulares Imprinting Modul 8: Ökonomie: Markt Forschung

15 Biophysik Gruppe am Institut für Physik PI M. Hegner Personen die diese Resultate ermöglicht haben: Dr. Y. Arntz Dr. P. Bertoncini Dr. T. Braun Dr. G. Bumbu Dr. K. Gfeller Dr. W. Grange Dr. E. Rebourt Dr. N. Nugaeva Dr. J. Zhang A. Breedekamp S. Husale Herzlichen Dank für Eure Aufmerksamkeit Nano Smiley (DNA-protein co deposition) 57 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 58 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Anhang Fluss der genetischen Information Replikation Transkription Translation Prionen DNA RNA Protein DNA Polymerase RNA Polymerase Ribosom Molekulare Motoren 59 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 60 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner

16 Grenzflächen z.b. Gold Glimmer Gold Epoxy-Leim (EP-TEK 377) Silizium Wafer der Deckglass Ultraflaches Gold Gold mittlere Rauheit ca. 4-5 Å über 100 µm 2 Auf Gold können wir Biomoleküle spezifisch verankern 2 µm 2 µm Z = 50 nm Hegner et al. Surf. Sci. 291 (1993) 39 Wagner et al. Langmuir11 (1995) Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner STM Bilder: Tunnel Strom (Itun) 1 na und Spitzen Spannung (Vbias) mv vorher Z = 50 nm Z = 5 nm nachher TSG Momentum eines Photons P = h/λ Bead 62 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner P 1 F = dp/dt Reaktions Kraft auf Kügelchen: F = (W/c) n b sinθ Sammel-Linse transformiert Austrittswinkel in Strahlen ffset (nach Abbe sine Bedingungen): X i = R L n b sinθ i Positions-sensitiver Licht Detektor summiert über alle Licht Strahlen und ergibt ein Signal P 2 Θ Externe Kraft wird berechnet nach: F = S/R L c Unabhängig von Partikel Grösse, Form oder Brechungsindex des Puffers P S = ΣX i W i P = Momentum des Photon W = Energie des Lasers c = Lichtgeschwindigkeit n b = Refraktiver Index des Mediu R L = Fokal Länge der Linse Kraft Messung mittels Momentum des Lichts BJ Puffer BJ Luft Wellenlänge: 830 nm Intensität: 200mW (per Laserdiode) BJ Externe Kraft BJ X R EX Layout des Herz des Instruments lympus 1,2 N.A. 60x Wasser Immersion WD 280 µm Detektor Detektor Maximum Kraft der Falle (~220 IfP) F Max =(W/c)/(r Rück-Appertur -r Strahl )/R L 63 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner 2R L Diese Art Messung sollte nicht benützt werden in einer Einzel-Strahl Falle, weil ein solch schmaler Licht Konus (wie oben gezeigt) ein bjekt nicht effizient festhalten kann. Wenn man die Rück-Appertur komplett ausfüllt, dann hat man einen grossen Gradienten der ein bjekt festhalten kann, aber dann kann man nach einer Ablenkung nicht alle Photonen auf dem Detektor einsammeln. Vakuum-Druck Expansions-Flaschen Flüssigkeits-Zufuhr 64 Nano I Vorlesung WS 02/03 PD Dr. M. Hegner Flüssigkeits-Kammer: Zwei Deckgläser mit Parafilm; Kanal für Mikro- Pipette Automatische Spritze