Validierung der Einzelzell-Kraftspektroskopie als Methode zur Quantifizierung der zellulären Initialadhäsion an Biomaterialien

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1 1 Validierung der Einzelzell-Kraftspektroskopie als Methode zur Quantifizierung der zellulären Initialadhäsion an Biomaterialien 1, Nadine Höppner 2, Klaus Liefeith 1 1 Institut für Bioprozess- und Analysenmesstechnik e.v., Heilbad Heiligenstadt 2 Max Planck Institut für Dynamik und Selbstorganisation, Göttingen

2 Motivation / Relevanz 2 - Race for the surface * - implantatassoziierte Infektionen - scaffoldbasiertes Tissue engineering - zellfreie Knochen/ Knorpeltherapie Wie lässt sich die initiale Adhäsion von Zellen auf einem Biomaterial quantifizieren? *Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Gristina AG, Naylor P, Myrvik Q. Med Prog Technol ;14(3-4): Review

3 Stand der Technik 3 Adhäsionsassays: - Adhäsions- / Proliferationsassays - Assays auf der Basis von Scherstress - Waschassay - Spinning Disc Assay - lateral flow Assays - direkte Messung der Adhäsionskräfte über: - Optische Pinzette - Mikropipette (inkl. Fluid-AFM) - AFM / SCFS (Single Cell Force Spectroscopy) Alle Methoden messen Systemeigenschaften

4 Messsystem 4 Basis: JPK Nanowizard CellHesion z = 100 µm Flüssigkeitszelle PetriDishHeater (RT - 60 C) z = 100 µm top-view-optik Fluoreszenzmikroskop aktive Schwingungsisolation KPM-Modul - Arbeiten in Flüssigkeit möglich - Temperierung möglich - Licht- und Fluoreszenzmikroskopie möglich - z-hub 100 µm - Kaum Limitationen für biologische Untersuchungen

5 Single Cell Force Spectroscopy 5 Methode: Immobilisierung von Zellen am AFM-Cantilever sehr kurze Kontaktzeit (10s-20s) Rückzug des Cantilevers Messung von Bindungsereignissen und Adhäsionskräften Zelllinie: MC3T3 E1 Vorkultur: 3d nach Taubenberger 2013, geändert

6 Cantileverfunktionalisierung 6 Cantilever: NanoWorld, Arrow TL1 Beschichtung mit Poly-D-Lysin Vorteile: a) sphäroide Zellmorphologie bleibt erhalten b) keine spezifischen Interaktionen, somit keine Zellreaktion durch die Immobilisierung c) einfache und schnelle Methode

7 Modelloberflächen 7 Modellsystem I: Physikochemische Variation

8 Modelloberflächen 8 Modellsystem I: Physikochemische Variation Benetzbarkeit 3 Durchgänge Reproduzierbare Herstellung von physikochemischen Zuständen

9 Modelloberflächen 9 Modellsystem II: Variation der Systemsteifigkeit - Polymersystem LCM - Precursorsystem für die 2PP - Grundbausteine: Methacryliertes Lactid und Caprolacton - hohe Variabilität des Systems - Einstellbarkeit von: - Benetzung - Degradation - Mechanik - biologischer Funktionalität

10 Modelloberflächen 10 Modellsystem II: Variation der Systemsteifigkeit - Variation der mechanischen Eigenschaften über die Kettenlänge der Precursoren - DMA (dynamisch mechanische Analyse) der Materialien nach DIN LCM Nr. Lactid/ Caprolacton Wiederholungseinheiten E-Modul [MPa] (10 Hz) : , : , : ,5

11 Ergebnisse 11 Auswertung der Daten - Parameter: a) max. Adhäsionskraft b) Adhäsionsarbeit c) Kontaktbereich - Statistik: minimal 5 Zellen pro Zelle Einzelkurven

12 Ergebnisse Modellsystem I: Physikochemische Variation über Thiolbeschichtung Adhäsionskarft [nn] F max * * * * [mn/m] - signifikantes Maximum der Adhäsionskraft und ~arbeit in einem Benetzbarkeitsbereich von Wasserkontaktwinkel - relativer Unterschied > 200% Adhäsionsarbeit [fj] W adh n.s. * * * [mn/m] * Mann Whitney Rank Sum Test; p>0,001 n.s. - nicht signifikant

13 Ergebnisse 13 Modellsystem I: Physikochemische Variation über Thiolbeschichtung Zellmorphologie MC3T3-E1 - Korrelation zwischen SCFS- Messungen und herkömmlicher Adhäsions- / Proliferationstestung [mn/m] 4 h 24 h Adhäsionskarft [nn] F max ,1-29,1 [mn/m]

14 Ergebnisse 14 Modellsystem II: Variation der Systemsteifigkeit durch Kettenlängenvariation des LCM Adhäsionskraft [nn] F max Adhäsionsarbeit [fj] W adh * * * * E-Modul [MPa] E-Modul [MPa] - signifikantes Erhöhung der Adhäsionskräfte auf Oberflächen mit geringerem E-Modul - relativer Unterschied > 200% * Mann Whitney Rank Sum Test; p>0,001

15 Ergebnisse 15 Modellsystem II: Variation der Systemsteifigkeit durch Kettenlängenvariation des LCM E [MPa] Zellmorphologie MC3T3-E1 4 h 24 h - Korrelation zwischen SCFS- Messungen und herkömmlicher Adhäsions- / Proliferationstestung 3,5 Adhäsionskraft [nn] F max ,8 17,1 E-Modul [MPa]

16 Schlussfolgerung Eine Biomaterialcharakterisierung mittels SCFS lässt sich reproduzierbar durchführen 2. Mit Hilfe der SCFS lassen sich Zellreaktionen auf physikochemische Eigenschaften von Biomaterialien quantitativ erfassen 3. Mit Hilfe der SCFS lassen sich Zellreaktionen auf viskoelastische Eigenschaften von Biomaterialien quantitativ erfassen 4. Ergebnisse der SCFS lassen sich mit herkömmlichen zellbiologischen Untersuchungen korrelieren

17 17 Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!