Inhaltsverzeichnis Einleitung ATP-Binding-Cassette Transporter ABC-Transporter Subfamilie A... 16
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- Linda Krause
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1 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Einleitung ATP-Binding-Cassette Transporter ABC-Transporter Subfamilie A ABCA2: Funktion und MDR ABC-Transporter Subfamilie G ABCG2: Funktion und MDR ABC-Transporter Subfamilie B P-gp: Funktion und MDR Modulatoren und Substrate von P-gp Subfamilie C Transportzyklus der ABCC-Subfamilie Subfamilie ABCC in der MDR Transporter ABCC1 (MRP1) Transporter ABCC2 (MRP2) Physiologische Funktion von MRP Physiologische Funktion von MRP Klinische Relevanz von MRP1 und MRP2 in der Krebstherapie Zielsetzung der Arbeit Methoden Hergestellte Lösungen Phosphatgepufferte-Kochsalzlösung ph 7,4 (PBS) Krebs-HEPES-Puffer ph 7,4 (KHP) Zellkultur Inkulturnahme von Zellen... 41
2 3.4 Kryokonservierung von Zellen Behandlung der Zellen mit Zytostatika Zelllinien A2780 Wildtyp und A2780 Adr Wildtyp, 2008 MRP1 und MRP MDCKII Wildtyp, MDCKII MRP1 und MDCKII MRP Bestimmung der Zellzahl und des Zellvolumens Membranpräparation (vereinfacht) Pufferherstellung Vorbereitung der Zellen Durchführung der Membranpräparation Proteinbestimmungen Grundlagen der Proteinbestimmungen nach Bradford Durchführung der Proteinbestimmung nach Bradford Grundlagen der Proteinbestimmung mit Amidoschwarz Hergestellte Lösungen für die Amidoschwarz Proteinbestimmung Durchführung der Proteinbestimmung mit Amidoschwarz SDS-Page und Western-Blot Grundlagen der SDS-PAGE und des Western-Blots Benötigte Puffer und Lösungen Durchführung der SDS-PAGE Durchführung des Western Blots (6)-Carboxy-2',7'-dichlorofluoresceindiacetat (CDFD) Uptake Assay Funktionsweise des CDFD-Assays Durchführung des CDFD-Assays im FACS -Röhrchen Durchführung des Microplate-CDFD-Assays... 58
3 Funktionsweise der Durchflusszytometrie Daunorubicin-Efflux-Assay Grundlagen des Daunorubicin-Efflux-Assays Durchführung des Daunorubicin-Efflux Assays Datenanalyse des Daunorubicin-Efflux Assays Calcein-AM-Assay Grundlagen Calcein-AM-Assay für MRP1 und MRP Calcein-AM-Assay für P-gp Kombinationsassays mit zwei Modulatoren Datenanalyse der Calcein-AM-Assays MTT-Assay Funktionsweise des MTT-Assays Durchführung des MTT-Assays Der MTT-Assay als Kombinationsassay mit zwei Substanzen Datenanalyse des MTT-Assays Cisplatin-Uptake Grundlagen des Cisplatin-Uptakes Grundlagen der flammenlosen Atom-Absorptionsspektroskopie Probenvorbereitung der Cisplatin-Uptake-Versuche Kalibrierung der AAS Inprozesskontrolle durch Process Quality Control (PQC) Proben Lyse der Zellpellets Durchführung der AAS-Messung Datenanalyse des Cisplatin-Uptakes Bestimmung des intrazellulären Glutathiongehalts und des Glutathion-Effluxes... 76
4 Grundlagen der Glutathion-Bestimmung Herstellung der Kalibriergeraden Herstellung der Qualitätskontrollen Durchführung der intrazellulären Glutathionbestimmung Durchführung der Bestimmung des Glutathion-Effluxes Datenanalyse der Glutathion-Bestimmungen Allgemeine Methoden der Datenanalyse Statistische Kennzahlen Statistische Tests: - und -Test Korrelationen Ausreißer-Test Eingesetzte Computerprogramme Ergebnisse und Diskussion Charakterisierung der Zelllinien mittels Western-Blot Auswertung der Blots Zusammenfassung der Western Blot-Ergebnisse Funktionelle Charakterisierung von MRP2 mittels CDFD CDFD-Assay im Röhrchen Zusammenfassung der Ergebnisse der CDFD-Assay Röhrchen-Versuche Funktionelle Charakterisierung mittels Calcein-AM Etablierung des Calcein-AM-Assays für MRP Funktioneller Nachweis von anderen Transportproteinen in MRP1 transfizierten Zellen Vergleich der biologischen Daten mit Literaturdaten MRP1 Calcein-AM-Assay in MDCKII MRP1 und MDCKII Etablierung des Calcein-AM-Assay für MRP
5 4.4 Verbindungen vom Benzimidazoltyp (LM-Verbindungen) in Calcein-AM-Assays Allgemeiner Aufbau der LM-Verbindungen Biologische Aktivität an MRP1 und MRP Struktur-Wirkungsbeziehungen Inhibitorische Aktivität gegenüber P-gp Dreidimensionale quantitative Struktur-Wirkungsbeziehungen (3D-QSAR) der LM- Verbindungen Berechnung der Molekülfelder und Erstellung des 3D-QSAR-Modells D-QSAR-Modelle der LM-Verbindungen Gü-Verbindungen als selektive Modulatoren für MRPs Aufbau der Modulatoren Struktur-Wirkungsbeziehungen für MRP Erstellung eines Pharmakophormodells Gü-Verbindungen als Aktivatoren an MRP Gü-Verbindungen vom p-aminobenzoesäure-typ Allgemeiner Aufbau der Modulatoren Struktur-Wirkungsbeziehungen für MRP1 und MRP Allgemeine Diskussion der Ergebnisse der MRP-Inhibitoren Glutathion Halbquantitative Bestimmung des intrazellulären Glutathions Etablierung des Glutathion Efflux-Assays Einfluss ausgewählter Modultoren auf den Glutathion-Efflux MRP2 in der Cisplatinresistenz MTT-Assay Cisplatin-Uptake Cisplatin Uptake in Kombination mit BSO
6 Zusammenfassung MRP2 in der Cisplatinresistenz Kombinationsassays zur Charakterisierung des Bindungsverhalten an MRP Dose-Ratio-Auswertung Aufklärung der Anzahl interagierenden Bindungsstellen im Dixon-Plot Enzymkinetischer Auswertungsansatz Zusammenfassung der Ergebnisse aus den Kombinationsassays in MRP Zusammenfassung Referenzen Abbildungsverzeichnis Tabellenverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Anhang Zellkultur- und Verbrauchsmaterialien Chemikalienliste Geräte und Zubehör CDFD Assay für das MAS des FACS Daunorubicin Efflux-Assays Daunorubicin-Efflux-Assay für ABCB1 und MRP Weitere 3D-QSAR-Modelle für die LM-Verbindungen Zytotoxizitätstest ausgewählter Modulatoren Aktivität der Gü-Verbindungen an ABCB Auswahl unwirksamer Gü-Verbindungen Testung von Phenylnannolon 150E aus Myxobacterium Nannocystis exedens Veröffentlichungen Wissenschaftliche Originalarbeiten Abstrakta/Kongressbeiträge
7 Erklärung Curriculum Vitae...256
Abkürzungsverzeichnis... 7. Inhaltsverzeichnis... 11. Abbildungsverzeichnis... 17. 1 Einleitung... 21 1.1 Proteomik... 21 1.1.1 Proteom...
Inhaltsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis... 7 Inhaltsverzeichnis... 11 Abbildungsverzeichnis... 17 1 Einleitung... 21 1.1 Proteomik... 21 1.1.1 Proteom... 21 1.1.2 Protein-Protein Interaktionen allgemein...
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