Methoden-Kurs - Teil UV/Vis-Spektroskopie. Spektroskopische Methoden

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1 Methoden-Kurs - Teil UV/Vis-Spektroskopie Dr. Markus berthür Fachbereich Chemie, Uni Marburg Raum 6217 oberthuer@chemie.uni-marburg.de 1 Spektroskopische Methoden Spektroskopie: Überführung von Molekülen von einem energiearmen Zustand in einen energiereicheren Zustand, wobei die notwendige Energie in Form von elektromagnetischer Strahlung zugeführt wird. Die absorbierte Frequenz entspricht den unterschiedlichen Energieniveaus des Moleküls, die wiederum Rückschlüsse auf die Struktur zulassen. angeregter Zustand ΔE = hν Frequenz ν = c / λ Grundzustand Wellenzahl ~ ν = 1 / λ NMR Mikrowelle IR UV/VIS Kernübergänge Rotation Schwingung Elektr. Übergänge λ = m ν = MHz λ = mm λ = μm ~ ν = cm -1 λ = nm 2

2 Anwendungen ) Kinetikmessung von (langsamen) Prozessen, z.b. Biotransformationen. g) Detektion von DNA, Proteinen h) Strukturbestimmung (UV-, CD-Spektroskopie) Vorteile: sehr sensitiv, sehr schnelle Detektion 3 UV/Vis-Spektroskopie Handelsübliche UV/VIS-Spektrometer: nm (UV: Wasserstoff- oder Deuteriumlampe, VIS: Wolfram-Halogenlampe) 4

3 Messanordnung 5 Lambert-Beer sches Gesetz A = E = Extinktion = log I 0 /I = ε. c. d A = E I 0 I ε c d = Extinktion (dimensionslos) = Intensität des eingestrahlten Lichts = Intensität des eingestrahlten Lichts = molarer Extinktionskoeffizient [cm 2 /mmol] = Konzentration [mol/l] = Schichtdicke der Küvette [cm] ε (λ) = UV-Spektrum 6

4 UV-Spektrum CH 3 7 Elektronische Übergänge Elektronenübergänge Absorptionsbereiche E σ λ σ σ n π n σ π n nm n π π π konjugiert konjugiert π π π σ σ n σ σ 8

5 UV-Spektrum Beobachtete Übergänge: π - π * n - π * CH 3 Bandenverbreiterung Unterschiedliche Intensität 9 Elektronische Übergänge E r Franck-Condon-Prinzip: vertikale Übergänge, d.h. die Molekülparameter (Bindungslängen, -winkel, etc.) bleiben während des elektronischen Überganges gleich. Folge: Schwingungs-Feinstruktur bzw. Verbreiterung der Banden 10

6 Elektronische Übergänge Die Intensität der beobachteten Banden hängt von der szillatorstärke f ab: f ~ μ 2 μ = Übergangsdipolmoment f 1 (erlaubte Übergänge) f << 1 (verbotene Übergänge) f ~ ε Auswahlregeln 11 Auswahlregeln: Elektronische Übergänge Spinerhaltung: Gesamtspin bzw. Multiplizität M = 2 S + 1 darf sich nicht ändern Symmetrie: Parität muss sich ändern g u (Verhalten des Vorzeichens der Wellenfunktion bei Inversion durch Symmetriezentrum) Überlappung der rbitale (n - π * Übergang der C=-Gruppe ist verboten) Aber: auch unerlaubte Banden können beobachtet werden, z. B. auf Grund der Verzerrung der Molekülgeometrie durch Schwingungen oder Spin-Bahn-Kopplung. 12

7 UV-Spektrum (erlaubt) CH 3 (verboten) 13 Chromophore Chromophore: Atomgruppen eines Moleküls, die UV/VIS-Strahlung absorbieren Beobachtete Übergänge: π - π* n - π* σ* n-π* n-σ* n - σ*, Aromaten 14

8 Auxochrome Chromophore: Atomgruppen eines Moleküls, die UV/VIS- Strahlung absorbieren Auxochrome: Atomgruppen benachbart zu einem Chromophor, die das Absorptionsmaximum und/oder den Extinktionskoeffizienten beeinflussen. bathochrom: hypsochrom: langwellige Verschiebung kurzwellige Verschiebung hyperchrom: hypochrom: Erhöhung der Intensität Erniedrigung der Intensität 15 Auxochrome Beispiel: Konjugation von Doppelbindungen π π π π π π Je grösser das konjugierte System, desto langwelliger und intensiver ist der energieärmste π π* Übergang. bathochromer + hyperchromer Effekt Polyene absorbieren im sichtbaren Bereich (β Carotin, 11-Retinal) 16

9 Auxochrome Beispiel: Bathochromer Effekt von Gruppen mit freiem Elektronenpaar A 1 A 2 A 1 > A 2 d.h. λ(1) < λ(2) langwellige Verschiebung Ausserdem: Einfluss von Lösungsmitteln auf Absorption (Solvatation der unterschiedlich polaren elektronischen Zustände) 17 Absorptionsregeln von Woodward und Fieser Für konjugierte, substituierte π-systeme, wie sie z. B. in Steroiden vorkommen, sind die Einflüsse der Substituenden auf das Absorptionsmaximum oftmals additiv, was eine Berechnung nach einem Inkrementsystem ermöglicht. 18

10 Anwendungen der UV/Vis-Spektroskopie (s-trans) (s-cis) acyclisches Dien 217 (s-trans) 19 Beispiel für Inkrementberechnung x 5 1 x Eine unbekannte Verbindung hat ein Absorptionsmaximum bei λ = 241 nm. Welche der Strukturen A oder B ist wahrscheinlicher? 20

11 Beispiel für Inkrementberechnung x 5 1 x Eine unbekannte Verbindung hat ein Absorptionsmaximum bei λ = 241 nm. Welche der Strukturen A oder B ist wahrscheinlicher? 21 Übungen R Ac A B 22

12 Carbonylverbindungen Gesättigte Aldehyde/Ketone: π π*, n σ* Übergänge (erlaubt): <190 nm n π*, Übergänge (verboten): nm α,β-ungesättigt - n-rbital bleibt gleich, π-rbital wird angehoben, d.h. die längerwellige Verschiebung ist stärker für den π π*- als für den n - π* -Übergang π π* überholt n π* Übergang bei längeren konjugierten Systemen 23 Inkrementberechnung R = Alkyl 215 nm (bathochrom) R = H 210 nm R = R' 195 nm (hypsochrom) Cyclopentenone 202 nm α- Substituent R- (Alkyl Group) Cl- (Chloro Group) Br- (Chloro Group) H- (Hydroxyl Group) R- (Alkoxyl Group) RC 2 -(AcylGroup) β- Substituent R- (Alkyl Group) Cl- (Chloro Group) Br- (Chloro Group) H- (Hydroxyl Group) R- (Alkoxyl Group) RC 2 - (Acyl Group) RS- (Sulfide Group) R 2 N- (Amino Group) γ & δ- Substituents R- (Alkyl Group) H- (Hydroxyl Group) R- (Alkoxyl Group) Further π -Conjugation C=C (Double Bond) C 6 H 5 (Phenyl Group) +10 nm nm nm (both γ & δ) +50 nm (γ) +30 nm (γ) Exocyclic C=C Homoannular cyclohexadiene

13 Konjugierte Carbonylverbindungen x 286 nm (290 nm gem.) 25 Konjugierte Carbonylverbindungen x Existieren zwei mögliche Systeme, so wird das höher substituierte gewählt. 244 nm (244 nm gem.) 26

14 Übungen H Et Benzol und Aromaten α-bande nicht sehr intensiv, aber wichtig für28 Detektion von Aromaten (HPLC)

15 Anwendungen 1. Bestimmung von Dissoziationsgleichgewichten (siehe H-M-Z) 2. Bestimmung von Reaktionsverläufen 3. Reaktionskinetiken (HPLC + UV- und MS-Detektion) 4. Konzentration von Protein- und DNA-Proben 5. Chiroptische Methoden (Drehwert, CD- und RD-Spektroskopie) Sekundärstruktur von Proteinen und DNA 6. Fluorereszenzmessungen Bestimmung des Reaktionsverlaufs Bsp.: Abspaltung von Schutzgruppen in der Festphasensynthese Fmoc: N H R H Fmoc-geschützte Aminosäure + H 2 N Kupplungsreagenz N H R H N Effizienz? N H Piperidin Detektion über UV + H 2 N R H N + C 2 30

16 3. Reaktionskinetiken (HPLC + UV-Detektion) UV-Detektion bei 270 nm: Enzym (GtfD) NMR: Detektion von DNA, RNA und Proteinen DNA, RNA absorbiert im UV bei einem Maximum von 260 nm (aromatische Nukleobasen, z. B. Thymin).D. 260 (optische Dichte) Messung, Detektion: ng/μl Faustregel: c = 50 μg/ml A (260 nm, 1 cm) = 1 oder: Detektion mittels fluoreszenz-gelabelter ligonukleotide (pg/ μl) Proteine absorbieren bei einem Maximum von 280 nm. (Tryptophan, Tyrosin).D. 280 (optische Dichte) Messung, Detektion: μg/μl Faustregel: c = 1 mg/ml A (280 nm, 1 cm) = 1.D. 260 /.D. 280 wird zur Reinheitsbestimmung von DNA bzw. Proteinen genutzt. 32

17 Extinktionskoeffizient von Proteinen Denaturiertes Protein: Einflüsse der Proteinkonformation werden eliminiert 33 DNA-Hybridisierung 34

18 DNA-Hybridisierung Chiroptische Methoden Chirale Substanzen interagieren unterschiedlich mit rechts- oder links-circular polarisiertem Licht! isotrop linear polarisiert circular E-Feld Vektoren ( enantiomer ) Brechungsindex: η = c 0 / c c = Geschwindigkeit im Medium c L c R η L η R Absorption: A = ε. c. d ε = Extinktionskoeffizient ε L ε R 36

19 Drehwert c L = c R : c L c R : 37 Drehwert Physikalische Grundlage: c L c R Drehwert: spezifischer Drehwert: α ( λ, T, c, Lösungsmittel )!!! 22 Bsp.: [ α ] Na = +4.3 (c = 1.07, MeH) 38

20 RD-Spektroskopie RD: ptische Rotationsdispersion Messung: α (λ) bzw. Φ (λ) Physikalische Grundlage: c L c R Molare Drehung: H Φ Φ CH 3 λ λ Normale RD (ohne Absorption) Anomale RD (mit Absorption) Cotton Effekt 39 Cotton Effekt UV: CH 3 CH 3 3R 3S RD: CH 3 3R CH 3 3S 40

21 CD-Spektroskopie CD: Circulardichroismus, ε(λ) ε L ε R Unterschiedliche Absortption von links bzw. rechtszirkular polarisiertem Licht führt zu elliptisch polarisiertem Licht. optisch inaktiv Drehwert, RD CD (ε L ε R ) 41 CD-Spektroskopie CD: Circulardichroismus, ε(λ) ε L ε R Unterschiedliche Absortption von links bzw. rechtszirkular polarisiertem Licht führt zu elliptisch polarisiertem Licht. CD nur bei gleichzeitiger Absorption! 42

22 Anwendungen - Bestimmung der absoluten Konfiguration von organischen Molekülen - Bestimmung der Sekundärstruktur von Proteinen und DNA - Interaktion von Proteinen/DNA mit Liganden 43 Anwendungen Bestimmung der absoluten Konfiguration von organischen Molekülen mittels CD-Spektroskopie 1) Sektoren- und Helizitätsregeln (z. B. ktandenregel) empirische Regeln, Konformation des Moleküls muss bekannt sein! 2) Exciton-gekoppelte CD-Spektroskopie Wechselwirkung zwischen zwei Chromophoren, nicht-empirisch 44

23 ktandenregel Vorzeichen des CD-Signals <-> absolute Konfiguration (Atome in der Nähe des Chromophors beeinflussen das CD-Signal) x z Bsp: y Δε Me λ Me 45 Exciton-gekoppelte CD-Spektren Grundlage: Wechselwirkung zwischen zwei Chromophoren führt zu bisignaten (S-förmigen) CD-Kurvenverläufen Δε Δε λ λ Die Vorzeichen der Kurve lassen sich nicht-empirisch auf den absoluten Twist zwischen den elektrischen Übergangsmomenten der koppelnden Chromophore zurückführen. Die Chromophore können Teil des ursprünglichen Systems sein oder durch Derivatisierung eingeführt werden. 46

24 Exciton-gekoppelte CD-Spektren Bedingung: 2 benachbarte Funktionalitäten, die das Anbringen der Chromophore ermöglichen. J. rg. Chem. 1998, 63, Exciton-gekoppelte CD-Spektren chiral achiral R 1 R 2 HX H X =, NH Porphyrin-Absorption wird genutzt, d.h. Alkohol/Amin muss keinen Chromophor enthalten! J. Am. Chem. Soc. 2001, 123,

25 Strukturbestimmung von Proteinen CD-Spektren werden im Bereich der Absorptionen der Peptidbindungen gemessen. 49 Strukturbestimmung von Proteinen Annahme: CD-Spektrum des Proteins ist die Summe der einzelnen Sekundärstrukturelemente. 50

26 Fluoreszenz Emission! 51 Fluoreszenz S 1 T 1 Quantenausbeute: S 0 A IC IC F ISC Φ = k F k F + k IC + k ISC + k Q [Q] P A: Absorption (10-15 s) IC: internal conversion (1/k IC = s) Energieübertragung auf benachbarte Moleküle durch Stöße Dieser Prozess ist umso effiezienter, je kleiner die Energiedifferenz zwischen den Zuständen ist. Übergang von S 1 nach S 0 : In Aliphaten strahlungslos möglich, da viele, energetisch unterschiedliche Schwingungsfreiheitsgrade zur Verfügung stehen. F: Fluoreszenz (1/k F = 10-8 s) Fluoreszenzlicht hat größere Wellenlänge als das absorbierte Licht Q, k Q : Fluoreszensquenchung (z.b. durch 2 ) ISC: Intersystem Crossing (1/k ISC = 10-8 s) Wird durch Spin-Bahn-Kopplung möglich; Schweratome erleichtern ISC P: Phosphoreszenz 52

27 Anwendungen Fluoreszenz Fluoreszenzfarbstoffe Molekulare Sensoren für ph, Ionen, Zucker, Citrat, etc. Detektion von Proteinen und DNA durch Fluoreszenzmarkierung Untersuchung der Proteinfaltung (über Tryptophan oder gelabelt) Untersuchung von Hybridisierung, Protein-Ligand-WW (FRET) Imaging von Zellen, Biopolymeren, Proteinlokalisation mittels Fluoreszenzmarkierung oder Green Fluorescent Protein Fluoreszenzmikroskopie 53 Anwendungen Fluoreszenz Fluoreszenzfarbstoffe CH C 2 R H 3 C CH 3 N H R 2 N NR 2 S 2 Cl Fluorescein NH 2 Rhodamine Dansychlorid Br CH 3 N H 2 N Coumarin-Derivate NH 2 Ethidiumbromid 54

28 Instrumentation 1) Lichtquelle 2) Fluorophor 3) Wellenlängenfilter zur Isolierung der Emissionphotonen von den Excitationsphotonen 4) Ein Detektor zur Registrierung der Emissionsphotonen Fluoreszenzinstrumente, die unterschiedliche Informationen liefern: * Spectrofluorometer messen die Fluoreszenz von Lösungen (µl to ml). * Fluoreszenz-Mikroskope lösen die Fluoreszenz von Funktion der räumlichen Koordinaten in zwei oder drei Dimensionen auf (weniger als ~0.1 mm Durchmesser). * Fluoreszenz-Scanner, z. B. Microarray readers, lösen die Fluoreszenz von makroskopischen bjekten (Elektrophoresegels, Blots und Chromatogramme) als Funktion der räumlichen Koordinaten in zwei Dimensionen auf. * Flow-Cytometer messen die Fluoreszenz in einer Zelle, die von einem Analyten durchströmt wird. 55 Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) FRET ist eine abstandsabhängige Wechselwirkung zwischen angeregten Zuständen von zwei Farbstoffmolekülen, bei der die Anregungsenergie von dem Donorauf das Akzeptormolekül ohne Emission eines Photons übertragen wird. - Abstand Å - Donorfluoreszenz und Akzeptorabsorption müssen überlappen - Foersterradius: Abstand, bei der FRET 50% wahrscheinlich ist. DNA Sensor Komplementäre DNA Anwendungen: Wechselwirkung von Biomolekülen, z. B. DNA-DNA, Protein-Ligand, etc. Bsp: Molecular Beacon FRET Fluoreszenz Doppelstrang DNA 56

29 Visualisierung von Zellen, Zellstrukturen Visualisierungsmöglichkeiten: Farbstoff, entweder direkt oder gebunden an - Enzyminhibitor oder Enzymsubstrat - organische Moleküle - Antikörper - Lipid - Lektin Fusionsprotein mit GFP (Green Fluorescent Protein) 57 Färbung des Zellkerns (DNA) NH 2 N R X S N C H N NMe 3 2 I NH 2 R = Et Ethidiumbromid Cyaninfarbstoffe nur fluoreszierend, wenn an DNA gebunden! R = Pr Propidiumiodid NH N H N N H 3 Cl Hoechst H N N H Et H 2 N NH 2 N H 2 Cl DAPI NH 2 NH 2 4',6-Diamidino-2-phenylindole 58

30 Färbung des Cytoskeletts Actin: Rhodamin- Derivat Alexa Fluor 546 Phalloidin (gelb, 573 nm) Tubulin: regon Green 488 Taxol Fluorescein- Derivat Flutax-2 (grün, 524 nm) 59 Färbung von Zellorganellen Mitochondrien: Endoplasmatisches Reticulum: MitoTracker Red (600 nm) BDIPY TR glibenclamide (rot, 620 nm) Golgi: BDIPY FL Ceramid (grün, 513 nm) 60