Das INEPT-Experiment
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- Edwina Fuhrmann
- vor 8 Jahren
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1 Das INEPT-Experiment Das Prinzip des Polarisations-Transfers (PT) ist im Zusammenhang mit dem heteronuklearen ( 13 C, 1 H) Experiment Selective Population Inversion (SPI) beschrieben worden. Hierbei wird im 1 H-NMR-Spektrum die Spin-Population eines (und nur eines) 13 C-Satellitensignals durch einen Grad-Puls invertiert, was zu einer Antiphasen-Polarisation des Signales des koppelnden 13 C-Kerns führt. Dieses Experiment hat mehrere Nachteile: - selektive Voreinstrahlung; Gefahr unzureichender Selektivität - genaue Kenntnis der Lage der 13 C-Satelliten erforderlich - nur eine Einstrahlstelle pro Experiment Besser ist ein Experiment, bei dem die Antiphasen-Orientierung der beiden 13 C- Satellitenübergänge durch eine Pulsfolge ohne selektive Einstrahlung und für alle 13 C, 1 H-Spinsysteme gleichzeitig möglich ist. Dieses Experiment ist INEPT (Insensitive Nuclei Enhancement by Polarisation Transfer). 1
2 Stellen wir uns wieder den einfachsten Fall des 1 H, 13 C -Spinsystems AX vor. E 1 ββ ( 1 H) A 1 X 1 ( 13 C) 1 H E α β βα E 2 3 ( 13 C) X 2 A 2 ( 1 H) 13 C E 4 α α Energiezustände und Übergänge des AX-Spinsystems INEPT-Pulsfolge 2
3 Die Pulsefolge zeigt im Protonenkanal einen Puls (a), gefolgt von einer Spin- Echo-Pulsfolge mit einer Wartezeit τ = 1/(4J); J ist wieder 1 J( 13 C, 1 H) = 125 Hz (b). Zeitgleich mit dem 1 H-Refokussierungspuls (c) wird ein Puls im 13 C-Kanal ausgelöst (d). Nach einer weiteren Zeit τ (e) erfolgt ein 1 H Puls, aber aus der y -Richtung zugleich mit einem Messpuls (f). I II II I I II I II II I 3
4 Wirkung der INEPT-Pulsfolge: Der erste 90 x 1 H-Puls legt die Magnetisierung auf die y -Achse (a). Da es im AX- System zwei 1 H-Übergänge gibt (I und II) laufen die beiden entsprechenden Magnetisierungsvektoren unterschiedlich schnell um. Nach der Zeit τ = 1/(4J) sind sie zueinander orthogonal (b) [τ = 1/J entspricht einem Phasenunterschied von (Einholen)]; das gleichzeitige Dephasing ist hier aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt. Der H-Puls kehrt die beiden Vektoren innerhalb der transversalen Ebene um (c), und gleichzeitig kehrt der C-Puls die beiden Spin-Labels (α bzw. β) um (d), d.h. der schnellere I ist nun wieder vorn. (Warum dieser C-Puls die Spin-Labels umdreht, wird im Anhang separat nachgewiesen.) Die zweite Zeit τ sorgt dafür, dass die beiden Vektoren am Ende antiparallel angeordnet sind (e); zugleich sind sie refokussiert. Der letzte 90 y - 1 H-Puls stellt diese antiparallelen Magnetisierungsvektoren in die longitudinalen Richtung (f). Dies ist genau die Situation, die im SPI-Experiment durch den selektiven Puls hervorgerufen wird, hier aber ohne selektive Einstrahlung und für alle Spinsysteme gleichzeitig; es ist der Augenblick der Spin- Polarisation (Mischzeit). Der C-Puls ist dann der eigentliche Messpuls für die polarisierten 13 C-Übergänge. 4
5 Eine entscheidende Erweiterung der INEPT-Pulsfolge stellt die Refokussierung der Magnetisierungsvektoren infolge einer J-Modulation dar, wobei während der FID- Aufnahme der 1 H-Entkoppler ein- oder ausgeschaltet sein kann. Entsprechend erhält man 1 H-ent- bzw. 1 H-gekoppelte 13 C-Signale. Refokussiertes INEPT mit optionaler 1 H-Entkopplung: 1 H 13 C 5
6 Die erste Wartezeit ist wieder τ 1 = 1/(4J), die INEPT-Wartezeit. Die zweite τ 2 sorgt für die J-Modulation. Allerdings ist die Zeitentwicklung nicht cos n (πjτ 2 ) wie beim APT-Experiment (s. zuvor), sondern sin(2πnjτ 2 ), mit n = Zahl der am C- Atom befindlichen Wasserstoffatome. τ 2 1/(4J) = 2 ms 1/(2J) = 4 ms 6
7 Bei τ 2 = 1/(4J) [2 ms] erhält man ausschließlich CH-Signale. Addiert man die Spektren mit τ 2 = 1/(8J) [1 ms] und τ 2 = 5/(8J) [5 ms], erscheinen nur CH 2 -Signale. Addiert man Sie Spektren mit τ 2 = 1/(12J) [0.667 ms], τ 2 = 5/(12J) [3.33 ms] und τ 2 = 3/(4J) [6 ms], erhält man nur CH 3 -Signale. Dieses Vorgehen nennt man Spectral Editing. Ein Beispiel (Cholesterylacetat) ist auf der folgenden Seite zu sehen. Quartäre Kohlenstoffatome geben keine INEPT-Signale, weil für sie kein Polarisationstransfer existiert; sie tauchen also in diesen Spektren gar nicht auf. Man erkennt sie durch Vergleich der INEPT-Spektren mit dem BB- 13 C-NMR-Spektrum. Spectral Editing ist zwar sehr elegant, aber unökonomisch, weil insgesamt sechs INEPT-Spektren aufgenommen werden müssen. Die gleiche APT- Information erhält man auch durch nur zwei Messungen, nämlich τ 2 = 1/(4J) [2 ms] für CH-Signale und τ 2 = 3/(4J) [6 ms] für positive CH und CH 3 sowie für negative CH 2 -Signale. 7
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9 Auch bei der Messung anderer Kerne ist das INEPT-Experiment sehr vorteilhaft. Dies gilt besonders für Kerne wie 15 N und 29 Si. Ersterer ist extrem unempfindlich, zumal seine natürliche Häufigkeit nur ca. 0.37% beträgt, aber das Verhältnis der relevanten magnetogyrischen Verhältnisse γ( 1 H)/γ( 15 N) ist mit ca. 10 sehr günstig für ein PT-Experiment. Man kann im Optimalfall für ein N-H-Fragment eine Polarisation von 10 erwarten, bei NH 2, NH 3 und NH 4 + sogar noch mehr. Beide Kerne, 15 N und 29 Si haben ein negatives magnetogyrisches Verhältnis γ, was mit einem negativen NOE einhergeht. Dies kann bei 1 H-Entkopplung zu einer Verkleinerung der Signale bis hin zur Annullierung führen, wenn nämlich wegen nicht-dominierendem dipolaren Anteil an der longitudinalen Relaxation ( s. NOE) nicht der volle NOE erreicht wird. Leider ist dies bei beiden Kernen sehr oft der Fall. Auf der folgenden Seite sind 29 Si-INEPT-Messungen mit Direkt-Messungen verglichen. Die Probe ist ein Siliconöl (CH 3 ) 3 Si-O-[Si(CH 3 ) 2 ] n -O-Si(CH 3 ) 3 ; J optimiert auf 2 J( 29 Si, 1 H). 9
10 10
11 ANHANG: Warum drehen sich die Spin-Labels bei gleichzeitiger Anwendung von H- und C-Puls um? Durch den C-Puls kehren sich die Populationen der 13 C-Übergänge um: E 1 β H β C α c β C und β c α C Betrachten wir die 1 H-Übergänge: ( 1 H) A 1 X 1 ( 13 C) Linie ohne π( 13 C) mit π( 13 C) α H β C β H α C E 2 E 3 A 1 α H β C β H β C α H α C β H α C ( 13 C) X 2 A 2 ( 1 H) A 2 α H α C β H α C α H β C β H β C E 4 α H α C A 1! A 2! Aus A 1 wird A 2, und aus A 2 wird A 1. Das ist die Umkehrung der Spin-Labels. 11
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