Biophysikalische Techniken

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1 Walter Keller Ruth Prassl Peter Macheroux Passwd: IfC-Keller Inhalt 1. UV/VIS- und CD/ORD-Spektroskopie 2. Kalorimetrie (DSC, ITC) 3. Mikroskopie (EM, 3D-Rekonstruktion) 4. Mikroskopie (Licht, Fluoreszenz, AFM) 5. Fluoreszenz 6. ESR/NMR, IR und RAMAN-Spektroskopie 7. Chromatographische Methoden 8. Massenspektrometrie 9. Streumethoden (SAXS, SANS, Light Scattering) 10. Strukturbestimmung (Kristallographie, NMR) 11. Proteinanalytik 12. Membranen und Lipide 13. Protein-Protein Wechselwirkung 14. Protein-DNA Wechselwirkung 15. 3D-Strukturen Modelling - Funktionsanalyse

2 Absorptions-Spektroskopie Das Energiespektrum des Lichts/elektromagnetischer Strahlung 1 c hc hc λ = = E = hν = bzw. E' E" = E = hν = ν ' ν λ λ Physikalische Grundlagen spektroskopischer Messmethoden a) unpolarisiertes Licht b) linear polarisiertes Licht c) zirkular polarisiertes Licht

3 Wechselwirkung Licht-Materie vt-x Moleküleigenschaften Die Eigenschaften von Molekülen werden durch die Verteilung der Elektronen zwischen den Atomkernen definiert. In Atomen ist die Verteilung der Elektronen durch die Atomorbitale (AO) gegeben. Zur Beschreibung von Molekülen verwendet man Molekülorbitale (MO). Es gibt bindende (σ,π), nicht bindende (n) und antibindende (σ*, π*) Molekülorbitale.

4 Moleküleigenschaften Durch eine elektromagnetische Strahlung kann ein elektronischer Übergang von einem bindenden oder nicht bindenden in ein antibindendes Orbital erfolgen. Dabei kann es auch zu einer Polarisierung der Elektronendichteverteilung kommen (induzierter Dipol). µ ind = αe (α = Polarisierbarkeit). Die Polarisierbarkeit α bestimmt, wie stark das Molekül mit der einfallenden elektromagnetischen Strahlung in Wechselwirkung tritt. Die Gesamtenergiebilanz ist gegeben als E ges = E el + E vib + E rot + E mag. Energieniveauschema für ein zweiatomiges Molekül. Jablonsky-Diagramm oder Term-Schema

5 Arten von Molekülspektren 1. Rotationsspektren 2. Schwingungsspektren 3. Elektronenspektren Weiters können Spektren von Atomen und Molekülen in die Klassen der Absorptions- und der Emissionsspektren eingeteilt werden. Absorptionsmessung Lambert-Beer'sches Gesetz I o log = E =ε. cd. I E = ε '. c'. D Extinktion vs. Transmission E = 2 logt

6 Photometertypen 1. Einstrahl-Photometer 2. Zweistrahl-Photometer 3. Diodenarray-Photometer äufige Fehler in der Photometrie a) fluoreszierende Probe b) lichtstreuende Probe

7 UV-Vis-Spektroskopie von Proteinen Proteine sind aus Aminosäure-Bausteinen aufgebaut. 2 N C α R COO N C α R1 O C N C α R2 O C N C α R3 O C N C α R4 O C N C α R5 O C Aminosäure Protein (Polypeptid) π-π*-übergang: λ max = 190 nm. nπ*-übergang bei λ = 220 nm (viel schwächer) ππ*-übergänge der Seitenketten λ = 280. UV-Vis-Spektroskopie von Proteinen Die Peptidbande wird von der Sekundärstruktur in Proteinen beeinflusst Das Proteinspektrum im nahen UV-Bereich wird von zwei Aminosäurenseitenketten dominiert: Trp und Tyr; drei weitere Aminosäuren (Phe, is und Cys) spielen eine untergeordnete Rolle

8 Chromoproteine Proteine, die Kofaktoren mit Absorptionsbanden im sichtbaren Bereich besitzen, nennt man Chromoproteine. Solche prostethischen Gruppen sind meist empfindliche Sonden für Proteinfunktion, da sich das Spektrum in Abhängigkeit von der Umgebung ändert. Beispiele für solche Liganden sind: Retinal in Rhodopsin Flavine Porphyrine Chlorophylle Retinal ist über eine schiff'sche Base an die ε-aminogruppe eines Lysinrests gebunden, was im Sehpigment Rhodopsin zu einer Rotverschiebung im Absorptionsspektrum führt Chromoproteine Absorptionsspektrum von oxidiertem und reduziertem Cytochrom C

9 Chromoproteine Redox-Titration von Cytochrom C: in einer spektroelektrochemischen Zelle wird die Absorption der α-bande in Abhängigkeit von dem angelegten Potential gemessen. Nernst-Funktion: p-abhängigkeit Tyrosin weist eine starke p- Abhängigkeit auf - Deprotonierung führt zum Auftauchen einer starken Bande bei 295 nm. Diese Veränderung kann zur Titration einzelner Tyr-Seitenketten in einem Protein genutzt werden (lokaler p-wert)

10 Absorptionsspektroskopie von Nucleinsäuren UV-Vis-Absorptionsspektren von Nucleinsäuren werden von den Basen dominiert. Absorptionsspektroskopie von Nucleinsäuren

11 Absorptionsspektroskopie von Nucleinsäuren Das Absorptionsspektrum einer Nucleinsäure setzt sich aus der Summe der Einzelspektren zusammen. Aufgrund des Stacking-Effekts benachbarter Basen kommt es zu einer Verringerung der Absorption: durch enzymatischen Verdau oder eine Erhöhung der Temperatur kann das Stacking aufgehoben werden (Temperaturabhängigkeit der Absorption). Diesen Effekt nennt man ypochromismus ("weniger Farbe"), und er gilt generell für interagierende Chromophore (z.b. Abnahme der Intensität der Peptidbande für intakte α-elices).

12 Optische Aktivität Asymmetrische Moleküle sind optisch aktiv: sie können die Ebene von linear polarisiertem Licht drehen und verwandeln das linear polarisierte in elliptisch polarisiertes Licht. Optische Aktivität Dieser Effekt wird bei zwei Arten von Spektroskopie genutzt: bei der optischen Rotationsdispersion (ORD) und beim Circulardichroismus (CD). Beide Methoden liefern korrespondierende Ergebnisse, die im Idealfall ineinander umgerechnet werden können. ORD: linear polarisiertes Licht wird eingestrahlt und man misst die Drehung der auptachse beim Durchtritt durch das optische aktive Medium. CD: es wird circular polarisiertes Licht eingestrahlt und der Extinktionsunterschied zwischen rechts und links circular polarisiertem Licht beim Durchtritt durch das optische aktive Medium gemessen. Dieser Extinktionsunterschied ε kann in die Elliptizität Θ umgerechnet werden. φ = 180 l (n L n R )/λ θ = (A L A R ) 180/4π [φ] = 100 φ / cl [θ] = 100 θ / cl [θ] = 3300 ε

13 CD und ORD CD und ORD- Signal können ineinander umgerechnet werden: Kronig-Kramers Transformation CD und ORD Elektrische und magnetische Dipol-Übergangsmomente können als lineare bzw. kreisförmige Bewegung von Ladung beim Übergang in einen angeregten Zustand dargestellt werden: bei einem CD-aktiven Übergang führt eine Kombination der beiden Bewegungen zu einer helicalen Ladungsverschiebung.

14 Berechnetes CD Spektrum einer α-elix CD Spektrum von poly-l-alanin α-helicale Konformation von poly-l-alanin: berechnetes (-----) und experimentell ( ) bestimmtes Spektrum

15 CD Spectra of Polypeptides and Proteins Sekundär-Struktur

16 CD - DNA daptpt dgptpt Literatur Cantor & Schimmel, Biophysical Chemistry II, Freeman &Co (1980). Rodger & Waden, Circular Dichroism and Linear Dichroism, Oxford UP (1997). Fasman, Circular Dichroism and the Conformational Analysis of Biomolecules, Plenum Press (1996). Lottspeich & Zorbas, Bioanalytik, Spektrum (1998).