1.5 Färbung und Farbstoffe

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1 1.5 Färbung und Farbstoffe Durch das Färben können bestimmte Zell- und Gewebestrukturen deutlich sichtbar gemacht und exakt und kontrastreich abgegrenzt werden. Voraussetzung dafür ist, dass sich die Farbstoffe aufgrund von chemischen oder physikalischen Faktoren selektiv in Zellen oder Strukturen anreichern. Dadurch lassen sich oft schon auf den ersten Blick Strukturen unterscheiden, die sonst kaum wahrnehmbar wären. Objekte erscheinen gefärbt, weil sie einen Teil des sichtbaren, weißen Lichtes absorbieren. Als Farbe nehmen wird das vom Objekt reflektierte Licht war. Welche Wellenlängen vom Präparat absorbiert werden und wie gefärbt wir es wahrnehmen hängt von den Farbstoffen ab, die darin enthalten sind Farbstoffe Die meisten Farbstoffe werden aufgrund von chemischen oder physikalischen Eigenschaften selektiv in Zellen oder Strukturen angereichert. In Farbstoffen liegen die färbenden Substanzen meist als Ionen vor. Trägt nun dieser Farbstoff eine positive Ladung, wird er als kationisch oder basisch bezeichnet. Ist das Farbstoff tragende Ion ein Anion, also negativ geladen, so spricht man von einem anionischen oder sauren Farbstoff. Abhängig vom ph Wert des Mediums sind die Farbstoffe dissoziert oder undissoziiert

2 Mechanismen der Farbstoffbindung Farbstoffe können durch mehrere Mechanismen sehr selektiv an Strukturen im Präparat binden. elektrostatische Bindung Durch elektrischen Ladungen werden Farbstoffe an entgegengesetzt geladene Zellkomponenten gebunden (zb Adsorbtion von kationischen Farbstoffen an der Zellwand). Ionenfalle: Beispiel: Ein Farbstoff liegt bei neutralem ph-wert undissoziiert vor; so kann er durch Membranen und das Cytoplasma diffundieren. Gelangt der Farbstoff in saure Kompartimente, dann dissoziiert er und kann in diesem Zustand nicht mehr durch die Membran zurück es erfolgt eine Anreicherung des Farbstoffes in diesen Kompartimenten chemische Bindung Die Farbstoffe gehen eine chemische Bindung mit bestimmten Molekülen des Präparates ein. sehr feste Bindung Komplexbildung 1. Erst durch eine Komplexbildung zwischen Farbstoff und bestimmten Zellkomponenten kommt es zu einer Farbreaktion. 2. Durch die Bildung von Komplexen entstehen meist unlösliche Niederschläge. Löslichkeit Lipophile und hydrophile Farbstoffe reichern sich nach ihrer Löslichkeit in unterschiedlichen Kompartimenten an. Teilchengröße Auf Grund ihrer Größe bleiben die Farbstoffteilchen in Hohlräumen stecken Einteilung der Farbstoffe primäre Farbstoffe oder natürliche Farbstoffe sind von Natur aus in den Zellen enthalten (Chlorophyll, Hämoglobin, Anthocyane,...) sekundäre Farbstoffe werden dem Objekt künstlich durch Färbung zugeführt. Als Sekundäre Farbstoffe können sowohl natürliche Farbstoffe wie zum Beispiel Safranin verwendet werden als auch synthetisch hergestellte künstliche Farbstoffe

3 Vital-Farbstoffe Bezeichnung für ALLE Farbstoffe die für lebende Zellen verwendet werden können Hellfeld-Farbstoffe (Diachrome) Diese Farbstoffe absorbieren einen Teil des sichtbaren Lichts und erscheinen damit im Mikroskop bei der Beleuchtung mit weißem Licht (Hellfeld) färbig. Sie können auch natürlich im Gewebe vorkommen (zb Chlorophyll, Hämoglobin oder Anthocyan) Fluoreszenz-Farbstoffe (Fluorochrome) Fluoreszenzfarbstoffe haben die besondere Eigenschaft, Licht nicht nur wie die Hellfeld-Farbstoffe zu absorbieren, sondern sie senden einen Teil des absorbierten Lichts auch wieder als Licht zurück Hellfeld-Farbstoffe Diese Farbstoffe absorbieren einen Teil des sichtbaren Lichts und erscheinen damit im Mikroskop bei der Beleuchtung mit weißem Licht (Hellfeld) färbig. Sie können natürlich im Gewebe vorkommen (zb Chlorophyll, Hämoglobin oder Anthocyan) oder durch Färbung zugeführt werden. Mit einigen Hellfeld-Farbstoffen können auch lebende Zellen gefärbt werden (Vitalfarbstoffe); hier ist die Färbung aber meistens nur sehr schwach und die Analyse erfordert viel Geduld und ein gutes Auge. Um eine stärkere Färbung zu erreichen muss die Farbstoffkonzentration meist schon so hoch sein, dass sie für die Zellen toxisch wird. Für die meisten Hellfeld-Farbstoffe ist eine vorhergehende Fixierung der Zellen notwendig. Außerdem kann bei fixierten Zellen mit einer höheren Farbstoffkonzentrationen gearbeitet werden; dadurch erhält man mit diesen Farbstoffen eine intensive Färbung des Präparates. Beispiele: Safranin, Auramin, Gentianaviolett, Malachitgrün für verholzte Zellwände Astrablau, Anilinblau, Mucicarmin, Eosin, für unverholze Zellwände Neutralrot Ionenfallen-Farbstoff für saure Kompartimente 119

4 Fluoreszenz-Farbstoffe Fluoreszenzfarbstoffe haben die besondere Eigenschaft, Licht nicht nur wie die Hellfeld-Farbstoffe zu absorbieren, sondern sie senden einen Teil des absorbierten Lichts auch wieder als Licht zurück. Trifft ein Lichtstrahl bestimmter Wellenlänge auf dieses Farbstoffmolekül so kommt es zur Absorption des Lichtstrahls und damit zur Anregung eines Elektrons, welches dabei in eine höhere Schale gehoben wird. Fällt das Elektron aus diesem instabilen Zustand auf seinen ursprüngliches Niveau zurück so gibt es die absorbierte Energie in Form von Wärme und Licht wieder ab. Anregung eines Elektrons Abgabe von Fluorezenzlicht Durch lange und/oder sehr intensives Anregungslicht nimmt die Intensität der Fluoreszenz ab, dieser Prozess wird als ausbleichen oder photobleaching bezeichnet. Stokes Shift Da ein Teil der absorbierten Lichtenergie als Wärme verloren geht ist das abgestrahlte Licht immer längerwelliger und damit energieärmer als das eingestrahlte Licht. Aufgrund dieses Phänomens leuchten die gefärbten Strukturen sozusagen von selbst, was im Mikroskop einen starken Kontrast zum dunklen Hintergrund ergibt. Daher ist die verwendete Farbstoffkonzentration bei Fluoreszenz- Farbstoffen sehr gering und damit auch oft sehr schonend für die Zellen. Bindung an Antibodies Eine Möglichkeit eine sehr selektive Färbung von bestimmten Proteinen zu erreichen ist die Verwendung von selektiven Antikörpern (Antibodies). Bei dieser Methode werden Antikörper gegen das gewünschte Protein erzeugt (in Ratten, Ziegen oder Mäusen) und diese dann mit einem Fluoreszenz- Farbstoff gekoppelt. Vorteil: Nachteil: selektive Anfärbung spezieller Proteine nur bei fixierten Zellen möglich, Antikörper können nicht durch die Plasmamembran diffundieren

5 Green Fluorescent Protein (GFP) Das Green Fluorescent Protein (grün fluoreszierende Protein) ist ein erstmals 1961 von Osamu Shimomura beschriebenes Protein aus der Qualle Aequorea victoria. Seine große Bedeutung liegt darin, dass es mit dem Gen eines anderen Proteins fusioniert und in die DNA jeder beliebigen Zelle eingebaut werden kann; synthetisiert nun die Zelle das gewünschte Protein, so wird automatisch ein GFP-Protein daran angehängt. Vorteil: Nachteil: Durch die grüne Fluoreszenz des GFP (Anregung mit blauem oder ultraviolettem Licht) kann die räumliche und zeitliche Verteilung des gewünschten Proteins in lebenden Zellen und Organismen direkt analysiert werden die Überexpremierung des Ziel-Proteins kann möglicherweise zu Anomalien im Zellgeschehen führen Färbemethoden Vitalfärbung: Färbung toter, fixierter Gewebe: Färbungen werden am lebenden Objekt durchgeführt wichtig für physiologische Untersuchungen ist unumgänglich wenn etwa Schnitte angefertigt werden müssen oder der Farbstoff in lebende Zellen nicht eindringen kann (zb. durch: semipermeable Membran, dicke Zellwand oder impermeable Cuticula). Schnittfärbung: Stückfärbung: Objekt wird zuerst geschnitten und dann die Schnitte gefärbt Das Präparat wird schon vor dem Schneiden gefärbt Transpirationsmethode: Injektionsmethode: Immersionsmethode: Die Pflanze wird direkt in den Farbstoff gesetzt, so dass dieser mit dem Transpirationsstrom aufgenommen werden kann (ähnlich wie Blumen in einer Vase) Messung von Phloemströmen, etc. der Farbstoff wird direkt in eine Zelle injiziert Analyse wo der Farbstoff eingebaut wird das Präparat wird in eine Farbstofflösung eingelegt und anschließend ausgewaschen 121

6 Progressive Färbung: Regressive Färbung: Einwirken des Farbstoffes bis der gewünschte Effekt eintritt nur geringe Farbstoffkonzentration notwendig Einlegen in stark konzentrierte Farbstofflösung dabei wird alles angefärbt durch Einlegen in Differenzierungsgemisch wird der Farbstoff dort herausgewaschen wo er nicht gut bindet, also von den Strukturen die er nicht färben soll Einfach-Färbung: es wird nur mit einem Farbstoff gefärbt Mehrfach-Färbung: dabei wird das Präparat mit mehreren Farbstoffen behandelt - Simultane Färbung die Farbstoffe werden als Mischung gleichzeitig aufgetragen Sukzedane Färbung die Farbstoffe werden einzeln und hintereinander aufgetragen. erzielt schönere Ergebnisse als die simultane Färbung Färbungen und Nachweise Im täglichen Umgang mit Nachweisreaktionen haben sich die folgenden Färbemethoden als erfolgreich und leicht anwendbar erwiesen. Für genauer Hinweise oder weitere Methoden siehe weiterführende Literatur. Übersichtsfärbung mit Alizidinviridin (Kerne, Nucleoli, Plasma, Chloroplasten, Pyrenoide) Fixierung in Chromsäure, 1%, 5 Minuten Einlegen in Alizidinviridin-Chromalaun Kerne, Nucleoli, Cytoplasma, Chloroplasten und Pyrenoide in abgestuften Grüntönen Methylenblaufärbung nach Löffler (Kerne und Plasma / Bakterienfärbung) Stammlösung: 2g Methylenblau in 100ml 70% Ethanol Färbelösung: 30 ml Stammlösung 69 ml destilliertes Wasser 1 ml 1% NaOH etwa Minuten färben, anschließend auswaschen. Blaufärbung von Kernen und proteinreichen Plasmabereichen 122

7 Doppelfärbung mit Safranin-Astrablau (verholzte / unverholzte Zellwände von Pflanzen) Herstellung eines Handschnittes Fixierung in Carnoy C, 5 Minuten (Alternativ: Verwendung eines entparaffinierten Mikrotomschnittes) Ohne Auswaschen einlegen in Safranin, 1%, in 50% Ethanol Differenzieren in 70% Ethanol (Bei Bedarf: absteigende Ethanolreihe) Einlegen in Astrablau, 2%, in 0,5% Weinsäure in Wasser verholzte Zellwände rot, unverholzte Zellulosewände blau Karmin-Essigsäure-Färbung (Chromosomen) Fixieren mit Carnoy C Ohne Auswaschen in Karminessigsäure einlegen (im Idealfall mehrere Tage) Erwärmen im siedenden Wasserbad (~1h) Bei zu starker Erwärmung bilden sich störende Ausfällungen!!!! Bei Bedarf: Quetschen Rotfärbung der Chromosomen Proteinnachweis mittels Xanthoproteinreaktion Entlüftung Fixierung in Carnoy C, 5 Minuten Farbstoffextraktion in warmem Ethanol, 70%, bis Objekt farblos Auswaschen des Ethanols in destilliertem Wasser Einlegen in 50% Salpetersäure, 5 Minuten; Proteine werden blaßgelb Einlegen in 10% Ammoniak; Färbung wird intensiver Nachweisreaktion für aromatische Aminosäuren in Proteinen Literatur Gerlach D. (1977): Botanische Mikrotechnik. Thieme, Stuttgart. 311 pp. Jensen, W. A. (1962): Botanical Histochemistry. Principles and Practice. Freeman, San Francisco. 408 pp