In vivo-nachweis der Bindung von HSF (heat shock factor) an Polytänchromosomen von Drosophila melanogaster

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1 In vivo-nachweis der Bindung von HSF (heat shock factor) an Polytänchromosomen von Drosophila melanogaster Sonja Prohaska A441 1 Einleitung Um sich vor Schäden zu schützen, die durch ungünstige Bedingungen wie Temperaturanstieg entstehen können, werden spezielle Zielgene aktiviert oder inaktiviert, um der Entstehung von Schäden entgegen zu wirken. Die Aktivierung oder Inaktivierung erfolgt über eine Kaskade von Expressionsänderungen, die mit der Aufnahme des Stresssignal (Temperaturanstieg heat shock ) durch den HSF ( heat shock faktor ) beginnt. Die im Cytoplasma vorhandenen HSF trimerisieren, wandern in den Kern und induzieren die starke Expression von Hitzeschock-Proteinen. HSF bewirkt die Expression einer Vielzahl von Genen direkt durch Bindung an die DNA in den regulatorischen Regionen der betreffenden Gene und darauf folgende Proteininteraktionen. Die Zielsequenzen, an die jene HSF binden, werden HSE ( heat shock elements ) genannt und liegen 5 -seitig vor dem Transkriptionsstart der Hitzeschock-Gene. Interphasekerne von Speicheldrüsen der Dipteren-Larven (z.b. Drosophila) enthalten Polytänchromosomen. Sie sind mit etwa µm Länge und µm Dicke im Lichtmikroskop deutlich sichtbar. Diese Strukturen entstehen durch Endomitose, bei der die Replikationsprodukte nach der Vervielfachung als Bündel parallel nebeneinander liegen bleiben und die Chromatid-Fäden ein Riesenchromosom bilden. Durch Färbung der Riesenchromosomen mit DNA färbendem Farbstoff (DAPI) wird eine Bänderung sichtbar. DNA-Abschnitte mit hohem Kondensationsgrad werden dabei stärker gefärbt (Banden: 95% DNA), Abschnitte mit einem geringeren Gehalt an DNA werden weniger stark gefärbt (Interbanden: 5% DNA). Transkriptionell stark aktive Regionen sind noch stärker aufgelockert, was im Mikroskop als Verdickung zu erkennen ist, und werden als Puffs bezeichnet (und schauen auch wie Puffreis aus). Übungen zur Zellgenetik SS April 2003

2 Fig. 1. Zusammenhang zwischen der Bindung von HSF und dem lokalen Phosphorylierungszustand von Histon H3. Bild A zeigt die am heat shock locus gebundene RNA Polymerase. Während des Hitzeschocks (Bild B) bindet der Transkriptionsfaktor HSF an die HSE am heat shock locus. Gebundener HSF rekrutiert eine Histon-Kinase (Bild C) welche Histon H3 am Ser 10 phosphoryliert. Setzt man Speicheldrüsenzellen von Drosophila-Larven im späten Entwicklungsstadium Standard-Umweltbedingungen (hier: 24 C) aus (auch als uninduziert bezeichnet), sind Ecdyson-induzierte Gene transkriptionell stark aktiv und die entsprechenden Regionen erscheinen als Puffs. Die Promotoren der Heat Shock-Gene sind zugänglich und mitunter mit der Polymerase besetzt, trotzdem kommt es nur zur Expression geringer Mengen von Heat Shock-Proteinen. Damit es bei Hitzeschock (hier: 36,5 C) in den Zellen ( induziert ) zu einer starken Expression kommt, ist noch die Phosphorylierung des Ser 10 im Histon H3 in der Region um das Gen herum notwendig. Die Phosphorylierung führt zur Lockerung der Packung von DNA und der Bildung von Heat Shock Puffs und wird vermutlich von einer Histon-Kinase durchgeführt, die durch HSF rekrutiert wird (siehe Fig. 1). Gleichzeitig werden die Ecdyson-induzierten Puffs in Anzahl und Größe reduziert, was zumindest einer Verlangsamung oder aber eine Repression der Entwicklung bewirkt. Dieser Prozess ist allerdings unabhängig von aktivem HSF. Auf den mikroskopisch sichtbaren Polytänchromosomen können sowohl die Regionen, an die HSFs binden als auch jene, in denen das Histon H3 phosphoryliert ist, durch anti-hsf-ak und anti-phosh3-ak sowie die entsprechenden sekundären AK angefärbt und sichtbar gemacht werden. Antikörper, die Histon H3 in dem speziellen Phosphorylierungstatus binden, sind aus der Färbung von Chromosomen in der Metaphase bekannt. 2

3 Table 1 Für die Färbung verwendete Präparate und Antikörper Phosphorylierung Hitzeschock-Induktion uninduziert 1 (-2) 3 (-1, -3, -4) induziert 1 (+2) 3 (+1, +3, +4) primärer AK anti-phosh3 (mouse) anti-hsf (rabbit) sekundärer AK anti-mouse-alexa488 anti-rabbit-tritc 1:500 1:250 grün rot Filter 4 Filter 5 2 Material und Methoden 2.1 Präparation der Polytänchromosomen Larven im spätesten Stadium vor der Verpuppung werden in PBS gewaschen und zerlegt. Die Speicheldrüsen werden von Fettkörpern getrennt, auf ein silikoniertes Deckglas transferiert und in 20 µl Fixativ (50 % Essigsäure, 3.7 % Formaldehyd) aufgenommen. Nach 4 min. Fixierungszeit wird das Deckglas mit einem Objektträger abgehoben. Durch Reiben mit einer Präpariernadel werden die Zellen aufgeschlossen und die Chromosomen gespreitet. Die fertigen Präparate müssen vor weiteren Arbeitsschritten 15 min. trocknen. Der Vorgang wird sowohl mit Larven durchgeführt, die bei Zimmertemperatur gehalten wurden (uninduziert), als auch mit Hitzeschock-induzierten Larven. Letztere werden durch Erwärmen auf 36,5 C für genau 25 min. in angestochenen Eppendorf-Gefäßen und einem Tropfen PBS (Achtung: Larven nicht ersäufen!) hergestellt. 2.2 Immunfluoreszenzfärbung Auf den fertigen Präparaten wird mit Diamantstift die Lage des Deckglases markiert. das Dekglas wird in flüssigem Stickstoff abgesprengt. Zur Fixierung erfolgt eine Lagerung in 95 % Ethanol bei Raumtemperatur. Rehydriert werden die Präparate durch Einstellen in 95 %, 70 %, 30 % Alkohol in PBS für je 5 min. Zum Entfernen des Alkohols werden sie anschliessend 3 mal jeweils 10 min. mit PBS gewaschen. Ein Deckglas wird mit BTP (0.5 % BSA, 0.1 3

4 % Tween 20 in PBS) mit dem Objektträger abgehoben und 15 min. in der feuchten Kammer aufbewahrt. Zum Blockieren unspezifischer Bindungen wird Horse Serum verwendet. Die verwendeten Antikörper sind in Tab. 1 aufgelistet. Ein Deckglas mit primärer Antikörper-Lösung (inklusive Horse Serum) wird mit dem Objektträger (nach Entfernen des letzten Deckglases) abgehoben und 40 min. in der feuchten Kammer aufbewahrt. Nach Abwerfen des Deckglases wird mit PBT gespült. Ein Deckglas mit sekundärer Antikörper-Lösung (inklusive Horse Serum) wird mit dem Objektträger (nach Entfernen des letzten Deckglases) abgehoben und über Nacht bei 4 C in der feuchten Kammer aufbewahrt und 3 mal 5 min. mit PBS gewaschen. Die Gegenfärbung erfolgte mit DAPI/antifade. Lagerung im Dunkeln bei -20 C. 3 Ergebnisse Fig. 2. Lokalisation von HSF an Chromosomen in uninduzierten Zellen. Links: Überlagerung von DAPI- (blau) und HSF-Färbung (rot) eines unzerbrochenen, sorgfältig gespreiteten Genoms. Rechts: HSF-Färbung mittels anti-hsf (rabbit) und anti-rabbit-tritc Antikörpern.[(C)copyright Sonja/Mathias] In erfolgreich gespreiteten Präparaten sind die 3 Chromosomen gut zu erkennen. Da die Schwesterchromatiden gepaart sind, erscheint der Chromosomensatz haploid. Chromosom 1 ist akrocentrisch, Chromosom 2 und 3 sind metacentrisch. Ihre Centromere sind miteinander verbunden, sodass das Genom eine fünfstrahlige Struktur bildet. Durch genauen Vergleich der Bänderung mit Chromosomenkarten können die Arme identifiziert werden. Hierfür war in unserem Kurs leider zu wenig Zeit. Sowohl in den uninduzierten als auch den 4

5 Fig. 3. Lokalisation von HSF an Chromosomen in induzierten Zellen. Links: DAPI Färbung eines ungebrochenen aber etwas stark verknäulten Genoms, dazu rechts: die HSF Färbung mittels anti-hsf (rabbit) und anti-rabbit-tritc Antikörpern. [(C) mit freundlicher Genehmigung der Gruppe 15] induzierten Präparaten ließ sich die spezifische Bindung von HSF an Chromosomen gut nachweisen. Die Färbung von phosphoryliertem Histon H3 ist bedauerlicherweise fehlgeschlagen. In uninduzierten Präparaten (Fig. 2) ist eine Bindung von HSF an diskrete Banden zu erkennen, welche aber nicht positiv mit den Ectyson Puffs korrelieren. Die Intensitäten der HSF-Färbung sind außerdem schwach im Vergleich zu den induzierten Präparaten (Fig. 3). Da keine Zuordnung der Arme und Banden erfolgte, ist es schwer zu sagen, ob durch Hitzeschock die vorhandenen HSF-Signale nur stärker wurden oder andere Abschnitte HSF-Färbung aufweisen. Es scheint jedoch, dass die HSF- Signale öfter in gepuffte Regionen (heat shock puffs) fallen. 5