DNA-Lokalisation durch situ Hybrisidisierung an Riesenchromosomen

Transkript

1 DNA-Lokalisation durch situ Hybrisidisierung an Riesenchromosomen Chromosomenpräparate sind leicht herzustellen Chromosomen sind für Anfänger leicht mikroskopisch zu analysieren Chromosomen zeigen strukturell interessante Details Nachweisempfindlichkeit ist mind. um Faktor 1000 höher als bei normalen Metaphase-C. Es handelt sich um Interphase-C., d. h. die Gene sind aktiv

2 Riesenchromosomen: Kernfäden entdeckt 1881 von Balbiani an Chironomus Larven Balbiani 1881

3 Polytänchromosomen sind riesig

4 Aufbau von Polytänchromosomen Puff Asynapsis Interbanden/ Banden

5 Polytänchromosomen bestehen aus vielen Chromatiden und zwei homologen Chromosomen Banden Interbanden

6 Chromsomen eines F1-Hybrids aus C. thummi x C. piger

7 Riesen-/Polytänchromosomen mit Balbiani-Ringen

8 Differenzielle Färbung zeigt aktive Gene Methylgrün(DNA blau)/pyronin (RNA rot)

9 Chromosomen mutationen sind leicht zu erkennen: z. B. Inversionsheterozygote

10 Drosophila melanogaster Polytänchromosomen

11 In situ Hybridiserung ( FISH )

12 Herstellung der Chromosomenpräparate: Präparate von Riesenchromosomen aus Speicheldrüsen von Dipterenlarven unser Organismus: Chironomus/Zuckmücken auch bekannt unter rote Mückenlarven (für Aquarienfreunde beliebtes Fishfutter)

13 Chironomus thummi- Imago:

14 Chironomus thummi: Lebenszyklus

15 Chironomus thummi (syn. riparius)

16 Chironomus als Bioindikator Güteklasse III: stark verschmutzt 1.Chironomus thummi, Rote Zuckmückenlarve 2. Helobdella stagnalis, Zweiäugiger Plattegel 3. Gomphonema olivaceum, Eifömrige Stielchen- Kieselalge 4. Tubifex, Schlammröhrenwurm 5. Erpobdella octoculata, Rollegel 6. Tetrahymena pyriformis, Birnenwimpertierchen 7. Erpobdella octoculata, Rollegel 8. Tubifex, Schlammröhrenwurm 9. Rotaria rotatoria, Rädertier 10. Chironomus thummi, Rote Zuckmückenlarve 11. Erpobdella octoculata, Rollegel 12. Carchesium polypinum, Wimpertierchen Gewässerabschnitte mit starker organischer, sauerstoffzehrender Verschmutzung und meist niedrigem Sauerstoffgehalt; örtlich Faulschlammablagerungen; flächendeckende Kolonien von fadenförmigen Abwasserbakterien und festsitzenden Wimpertieren übertreffen das Vorkommen von Algen und höheren Pflanzen; nur wenige, gegen Sauerstoffmangel unempfindliche tierische Makroorganismen wie Schwämme, Egel, Wasserasseln kommen bisweilen massenhaft vor; geringe Fischereierträge; mit periodischem Fischsterben ist zu rechnen.

17 Quetschpräparate : Speicheldrüse identifizieren und auf Objektträger bringen ein Tropfen 40-50%iger Essigsäure auftropfen Deckglas auflegen Deckglas leicht anpressen unter Mikroskop kontrollieren

18 Chironomus thummi: die Speicheldrüsen

19 Chironomus thummi: Präparation der Speicheldrüsen

20 Ablauf der Chromosomenpräparation Chironomus Larve auf Eis(wasser) betäuben Larve auf Objektträger mit Präpariernadeln dekapitieren Entweder rutschen Speicheldrüsen spontan aus dem Larvenkörper oder durch leichten Druck mit der Nadel herausdrücken Drüsen liegen paarig links und rechts des Vorderdarms Auftropfen von Essigsäure hilft beim Identifizieren der Drüsen Reste der Larve von den Drüsen und vom Objektträger entfernen Drüsen leicht mit Präpariernadeln in Essigsäure zerzupfen (nicht eintrocknen lassen!) Deckglas auflegen und andrücken; dabei werden Drüsenzellen gequetscht ( Quetschpräparate ); Zellen und Zellkerne platzen dabei und Chromsomen werden gestreckt Ergebnis unter Mikroskop kontrollieren Bei Erfolg (gute Chromosomen) Präparat mit Deckglas nach unten auf Trockeneis einfrieren Deckglas mit Skalpell/Rasierklinge absprengen und Objektträger unverzüglich in Isopropanol/Ethanol stellen

21 Wichtig: Deckglas absprengen solange Präparat eingefroren!

22 DNA-Lokalisation durch situ Hybrisidisierung an Riesenchromosomen Chromosomenpräparate sind leicht herzustellen Chromosomen sind für Anfänger leicht mikroskopisch zu analysieren Chromosomen zeigen strukturell interessante Details Nachweisempfindlichkeit ist mind. um Faktor 1000 höher als bei normalen Metaphase-C. Es handelt sich um Interphase-C., d. h. die Gene sind aktiv

23 Riesenchromosomen: Kernfäden entdeckt 1881 von Balbiani an Chironomus Larven Balbiani 1881

24 Polytänchromosomen sind riesig

25 Aufbau von Polytänchromosomen Puff Asynapsis Interbanden/ Banden

26 Polytänchromosomen bestehen aus vielen Chromatiden und zwei homologen Chromosomen Banden Interbanden

27 Chromsomen eines F1-Hybrids aus C. thummi x C. piger

28 Riesen-/Polytänchromosomen mit Balbiani-Ringen

29 Differenzielle Färbung zeigt aktive Gene Methylgrün(DNA blau)/pyronin (RNA rot)

30 Chromosomen mutationen sind leicht zu erkennen: z. B. Inversionsheterozygote

31 Drosophila melanogaster Polytänchromosomen

32 In situ Hybridiserung ( FISH )

33 Herstellung der Chromosomenpräparate: Präparate von Riesenchromosomen aus Speicheldrüsen von Dipterenlarven unser Organismus: Chironomus/Zuckmücken auch bekannt unter rote Mückenlarven (für Aquarienfreunde beliebtes Fishfutter)

34 Chironomus thummi- Imago:

35 Chironomus thummi: Lebenszyklus

36 Chironomus thummi (syn. riparius)

37 Chironomus als Bioindikator Güteklasse III: stark verschmutzt 1.Chironomus thummi, Rote Zuckmückenlarve 2. Helobdella stagnalis, Zweiäugiger Plattegel 3. Gomphonema olivaceum, Eifömrige Stielchen- Kieselalge 4. Tubifex, Schlammröhrenwurm 5. Erpobdella octoculata, Rollegel 6. Tetrahymena pyriformis, Birnenwimpertierchen 7. Erpobdella octoculata, Rollegel 8. Tubifex, Schlammröhrenwurm 9. Rotaria rotatoria, Rädertier 10. Chironomus thummi, Rote Zuckmückenlarve 11. Erpobdella octoculata, Rollegel 12. Carchesium polypinum, Wimpertierchen Gewässerabschnitte mit starker organischer, sauerstoffzehrender Verschmutzung und meist niedrigem Sauerstoffgehalt; örtlich Faulschlammablagerungen; flächendeckende Kolonien von fadenförmigen Abwasserbakterien und festsitzenden Wimpertieren übertreffen das Vorkommen von Algen und höheren Pflanzen; nur wenige, gegen Sauerstoffmangel unempfindliche tierische Makroorganismen wie Schwämme, Egel, Wasserasseln kommen bisweilen massenhaft vor; geringe Fischereierträge; mit periodischem Fischsterben ist zu rechnen.

38 Quetschpräparate : Speicheldrüse identifizieren und auf Objektträger bringen ein Tropfen 40-50%iger Essigsäure auftropfen Deckglas auflegen Deckglas leicht anpressen unter Mikroskop kontrollieren

39 Chironomus thummi: die Speicheldrüsen

40 Chironomus thummi: Präparation der Speicheldrüsen

41 Ablauf der Chromosomenpräparation Chironomus Larve auf Eis(wasser) betäuben Larve auf Objektträger mit Präpariernadeln dekapitieren Entweder rutschen Speicheldrüsen spontan aus dem Larvenkörper oder durch leichten Druck mit der Nadel herausdrücken Drüsen liegen paarig links und rechts des Vorderdarms Auftropfen von Essigsäure hilft beim Identifizieren der Drüsen Reste der Larve von den Drüsen und vom Objektträger entfernen Drüsen leicht mit Präpariernadeln in Essigsäure zerzupfen (nicht eintrocknen lassen!) Deckglas auflegen und andrücken; dabei werden Drüsenzellen gequetscht ( Quetschpräparate ); Zellen und Zellkerne platzen dabei und Chromsomen werden gestreckt Ergebnis unter Mikroskop kontrollieren Bei Erfolg (gute Chromosomen) Präparat mit Deckglas nach unten auf Trockeneis einfrieren Deckglas mit Skalpell/Rasierklinge absprengen und Objektträger unverzüglich in Isopropanol/Ethanol stellen

42 Wichtig: Deckglas absprengen solange Präparat eingefroren!