Histologische Technik (Teil 2)

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1 Histologische Technik (Teil 2) Der erster Teil beinhaltete die Schritte von der Gewebsentnahme bis zur Einbettung in Paraffin. Dieser 2. Teil umfasst die Arbeitsgänge vom Mikrotomschneiden bis zum fertigen Präparat. Auch jetzt wird nach einem festen Muster gearbeitet. Die Blöcke werden mit einem Mikrotom geschnitten; hierbei handelt es sich in diesem Beitrag um ein Rotations-mikrotom. Bei diesem bewegt sich das Gewebe vertikal zu einem fest stehenden Messer. Pflanzliches Material schneidet man vielleicht besser mit einem Schlittenmikrotom. Hier bewegt sich das Messer in Längsrichtung zum fest aufgestellten Material. Die Schnitte werden aufgezogen, entparaffiniert und gefärbt. Für diesen Beitrag wird die Färbung nach Mallory von 1900 vorgestellt. Die Schnitte werden zuletzt wieder entwässert und in Harz eingeschlossen. Nach Beschriftung und Archivierung können die Präparate in einem Präparatekasten für Jahre aufbewahrt werden, ohne dass die Schnitte an Farbbrillanz verlieren. 1. Gewebe schneiden mit dem Mikrotom 2. Schnitte auf einen Objektträger aufziehen 3. Zurück in Wasser bringen (Hydrieren) 4. Färben 5. Präparat haltbar machen. 1. Mikrotomschneiden Ein Mikrotom kauft man nicht jeden Tag. So soll zuerst über die Frage nachgedacht werden, was man möchte. Ein Mikrotom ist ein Präzisionsinstrument und somit nicht billig. Ein einfaches handgetriebenes aber sehr gut brauchbares Mikrotom ist z.b. ein A&O 820 (Bild 1). Damit lassen sich sehr gut Paraffinschnitte von hoher Qualität erzeugen. Wichtig ist nur, dass die Mechanik einwandfrei (kein Rost oder Spiel) ist, und gute Messer zur Verfügung stehen. Das Messer ist eigentlich das wichtigste Teil eines Mikrotoms. Es gibt Messer, die immer wieder nachgeschärft werden können, und Einwegmesser. In diesem Beitrag wird mit Leica 818 Einwegklingeln (Bild 2) geschnitten. Dazu dient ein passender Messerhalter, der oft nicht so einfach zu bekommen ist, oder man muss sich so ein Teil anfertigen lassen. Bild 2 Bild 1 R. Schulte Seite 1

2 Ein weitere Möglichkeit ist der Kauf eines aufwendigeren Mikrotoms (Bild 3), mit dem man später auch Kunststoffschnitte anfertigen kann. Eine gute Kaufberatung ist hier wichtig. Z.B. im Deutschen Mikroskopieforum: werden viele Diskussionen über Arten von Mikrotomen geführt, und es gibt öfters Schneidetipps zu lesen. Wenn der Block eingespannt ist und es ans Schneiden geht, kommt die Frage: Wie dick oder dünn soll ich schneiden? Die Frage ist nicht immer leicht zu beantworten. In der Histologie und Pathologie ist eine Schnittdicke von 4 bis 5 µm schon eher dick. In einem dicken Schnitt ist z.b. ein Dendrit einer Purkinjezelle im Kleinhirn besser zu verfolgen, aber das mikroskopische Bild wird auch unklar, weil sich mehrere Zellschichten überlappen. Ein dünner Schnitt von 1 bis 2 µm ergibt oft ein sehr detailreiches Bild, erfordert im Paraffin aber viel Übung. Um solche dünnen Schnitte in reproduzierbarer guter Qualität zu erzeugen, muss das Gewebe in Kunststoff gegossen werden. Bild 3 In Bild 4 und 5 ist das A&O im Einsatz. Wenn alles richtig gemacht wird, erhält man Schnittbänder. Bild 4 Für einen guten Schnitt empfehle ich: - Gutes Qualitäts-Paraffin verwenden (Paraplast lässt sich sehr gut schneiden) - Blöcke eine Nacht kühlen im Kühlschrank und erst unmittelbar vor dem Einspannen aus dem Schrank holen - Das Anschneiden des Blockes darf mit einem schon häufiger gebrauchten Teil des Messers erfolgen, für die eigentlichen Schnitte nimmt man aber ein neues Messer oder Messerteil - Das Handtriebrad gleichmäßig bewegen - Wenn die Luftfeuchtigkeit zu niedrig ist, kleben die Schnitte oft zusammen (Schnitte werden statisch). Man kann versuchen, einen Topf mit heißem Wasser in die Nähe zu stellen, aber ich schneide lieber am nächsten Tag. Bild 5 R. Schulte Seite 2

3 Um einen guten Schnitt zu bekommen, soll man viel üben. Ich habe ein Video von der Schneidearbeit in Youtube eingestellt (Bild 6). watch?v=qgye4p9xana Bild 6 2. Schnitte auf einen Objektträger aufziehen Um Schnitte oder Schnittbänder auf einem Objektträger (OT) zu befestigen, müssen sie vorher gestreckt werden. Das Häutchen Paraffin ist so dünn und fragil, dass ein Berühren mit der Hand nicht ohne Schaden bliebe. Darum verwendet man einen Pinsel und/oder eine Pinzette. Es ist auch möglich, die Schnitte direkt auf dem OT zu strecken, aber ich bevorzuge ein Strecken im Warmwasserbad (Bild 7). Die Wassertemperatur soll Zwischen 40 und 45 Grad liegen. Wenn das Wasser zu warm wird, fangen die Schnitte an zu schmelzen, wodurch sie wertlos werden. Die schon ab Werk gereinigten OTs sollten nochmals gereinigt werden mit einer Mischung aus Ethanol 96% und Aceton. Es gibt Histologen, die eine dünne Schicht von Eiweissglyzerin auf die OTs auftragen, um eine bessere Haftung des Gewebes zu erzielen; ich mache das nicht und gebrauche nur saubere OTs. Ein späteres Abschwimmen eines Schnittes durch Farbstoffe oder andere Chemikalien passiert nur selten. Bild 7 R. Schulte Seite 3

4 Das Aufbringen der Schnitte auf die Oberfläche des warmen Wassers ist auch wieder eine Übungssache. Wenn es mal nicht gelingt, und das passiert recht häufig, besteht ja keine Not, einfach einen neuen Schnitt herzustellen und wieder auf das Wasser aufzubringen. Die Schnitte strecken sich sofort, können aber ruhig einige Zeit im Wasser verbringen (Bild 8). Eine Minute Strecken reicht jedenfalls aus. Dann wird vorsichtig ein sauberer (und Ethanol-/Aceton- trockener) OT in das Wasser getaucht und der Schnitt hiermit aufgefischt. Durch Schräghalten des OT lauft das Wasser besser ab. Danach einfach trocknen lassen. Das Trocknen darf auf einer Wärmebank oer auf dem Rand des Wasserbades erfolgen, aber vorsichtig sein, dass auf keinen Fall der Schmelzpunkt des Paraffins überschritten wird. Trocknen in einer Präparatenmappe aus Pappe geht auch. Das Trocknen sollte möglichst lange, am besten über Nacht geschehen. Dann sind die Schnitte so weit, dass sie gefärbt werden können. Bild 8 Auf YouTube habe ich ein Video eingestellt, wo das Strecken gezeigt wird (Bild 9). m/watch?v=cbqnzr0 wx0i&feature=mfu_in_ order&list=ul Bild 9 R. Schulte Seite 4

5 3. Zurück in Wasser bringen (Hydrieren) Um die verschiedenen Gewebe unter dem Mikroskop studieren zu können, müssen sie zuerst gefärbt werden. Hierfür ist es notwendig, dass das Paraffin rückstandslos aus den Schnitten geholt wird und diese danach in Wasser gebracht werden. Die Reihenfolge der Chemikalien ist genau umgekehrt wie bei der Entwässerung am Anfang der histologischen Arbeit. Eine Ethanolreihe wird aufgebaut und besteht aus: -2 Xylolstufen -Isopropanol 100% -Ethanol 96% -Ethanol 85% -Ethanol 70% -Ethanol 50% -Aqua dest. (AD). Bild 10 Natürlich können mehrere Präparate in der Reihe gleichzeitig behandelt werden. Hier werden zwei Präparate simultan gewässert. Alle Stufen laufen vier Minuten. Ein einfacher Küchenwecker ist eine prima Hilfe. Die OTs gelegentlich in der Flüssigkeit bewegen. Hier verbringt Schnitt 1 in Xylol II und Schnitt 2 in Xylol I. Bild 11 Es ist sinnvoll, nach jeder Stufe den Überschuss an Flüssigkeit mit Zellstoff abzuwischen, die Schnitte dürfen hierbei aber nicht trocken. Hier wird Schnit 1 vom überwiegenden Teil des Xylols gesäubert. Bild 12 R. Schulte Seite 5

6 Schnitt 1 wird in Isopropanol 100% getaucht, während Schnitt 2 in der letzten Xylolstufe verbringt. Bild 13 Schnitt 1 ist schon in Ethanol 70% angekommen, während Schnitt 2 gerade vom Ethanol 96% zum Ethanol 85% wechselt. Bild 14 Nach einiger Zeit kommen die Schnitte im Wasser an und können dort einige Zeit verbleiben. Ein oder zwei Stunden sind okay, aber ein Tag ist zu lange - bindegewebsreiche Gewebe fangen an aufzuquellen. Bild 15 R. Schulte Seite 6

7 4. Färben Das Färben der Schnitte ist der schwierigste Teil der Histologie. Das Mikrotomschneiden war schon nicht einfach, jetzt beginnt die Meisterarbeit. Ich vergleiche es öfters mit dem Braten eines Steaks. Das kann im Prinzip jeder, aber nur der Meisterkoch bekommt es ideal saftig hin. So ist es mit dem Färben auch. Im Romeis, Mikroskopische Technik sind viele Rezepte zu finden. Dieses Buch sollte jeder haben. Bild 16 zeigt die ältere Ausgabe, die meiner Meinung nach die beste ist. Die neue Auflage auf Bild 17 geht öfters für den Amateur zu weit. Da braucht man häufig Instrumente und Farbstoffe, die zu teuer sind, und die speziellen Färbungen sind aufwendig. Es ginge zu weit, hier alle Details anzusprechen, dafür ist die Färbetechnik zu kompliziert. Nennenswert ist aber: - Progressives Färben ist eine Technik, bei der die Schnitte so lange im Farbstoff verbleiben, dass sie genügend gefärbt sind. - Beim regressiven Färben wird der Schnitt zuerst überfärbt und durch Differenzieren (Auswaschen) mit einer geeigneten Flüssigkeit der Überschuss an Farbstoff wieder entfernt. - Man kann einen Schnitt mit einem einzigen Farbstoff färben oder aber Doppel-, Dreifach-, oder Mehrfachfärbungen durchführen. - Die Färbung ist sehr abhängig von: - Färbezeit - Konzentration der Farbstofflösung - Färbetemperatur - Schnittdicke - Art der Fixierung. Bild 16 Bild 17 Bild 19 Bild 18 Bild 20 Vier Bilder von verschiedenen Färbungen. Bild 18, Zahnglocke mit PTAH gefärbt. (PTAH=Phosphorwolframhämatoxylin) Bild 19, Gleiche Zahnglocke in einer Trichrom- Färbung nach Mallory. Bild 20, Wirbelsäule in einer AZAN Färbung nach Heidenhain. Bild 21, Das Vomeronasalen Organ eine Maus in Klassische HE Färbung. Die HE (Hämatoxylin/Eosin) ist eine Routine-Färbung in histologischen- und Bild 21 pathologischen Labors. R. Schulte Seite 7

8 Zuerst sollte man sich die Farbstoffe beschaffen. Fertige Färbstofflösungen erhält man z.b. bei Chroma in Münster. Der Nachteil dabei ist, dass Farbstofflösungen mit der Zeit an Farbkraft verlieren und somit regelmäßig neue angesetzt werden müssen. Eine bessere Methode ist es, Farbstoffe als Pulver zu kaufen, wie auf Bild 22 gezeigt. Das Anilinblau/Orange G ist ein fertiges Gemisch, das Säuerefuchsin jedoch ein separater Farbstoff. Wie sie angesetzt werden müssen, ist im Romeis beschrieben. Bild 22 Die Färbung, die ich hier vorstellen möchte, ist eine Trichrom-Übersichtsfärbung nach Mallory. Frank Burr Mallory war ein US-amerikanischer Pathologe und Professor für Pathologie an der Harvard University. Sein Färbprotokoll stammt schon aus dem Jahre Er beschreibt eine Gewebe-Fixierung mit Zenker scher Flüssigkeit. Meine Erfahrungen mit Zenker sind gut, aber die Färbung gelingt auch sehr gut mit Bouin schem Fixiergemisch, und auch nach einer einfachen Formalin-Fixierung ist die Färbung noch möglich, wobei sie dann ggf. nicht gaz so kräftig ausfällt. Das Protokoll: - Schnitte in Wasser bringen - Säurefuchsin 0,25% in AD, 5Min - Spülen mit AD - Fixieren und Differenzieren in Phosphorwolframsäure 5% in AD, 5Min - Spülen in AD - Anilinblau/Orange G/Oxalsäure Mischung, 7Min - Spülen mit AD - Differenzieren in zwei Portionen Ethanol 96% bis keine Farbwolken mehr abgehen - Entwässern - Xylol und einschließen in Harz. In den meisten Büchern wird beschrieben, dass die Färbungen in speziell dafür geeigneten Küvetten erfolgen sollen. Meine Färbetechnik sieht ganz anders aus. Der Farbstoffverbrauch wäre für mich sonst viel zu hoch. Meist färbe ich nur einige Schnitte und gebe hierfür die Farbstofflösungen direkt auf den Objektträger. Bild 23 R. Schulte Seite 8

9 In diesem Färbegang werden zwei bereits gewässerte Schnitte gleichzeitig gefärbt. Bild 24: Die Schnitte werden nochmals mit AD gespült und horizontal über ein Becherglas gelegt. Bild 24 Bild 25: Die Arbeitsabläufe sind für beide Schnitte gleich. Bild 25 Bild 26: Das Fuchsin wird aufgebracht. Das Gewebe soll gut mit Farbstoff überschichtet werden. Bild 26 Bild 27: Den Farbstoff 5 Minuten einwirken lassen und die Flasche AD bereit halten. Bild 27 R. Schulte Seite 9

10 Bild 28: Den Farbstoff mit AD abspülen. Bild 28 Bild 29: Den Farbstoff mit AD abspülen. Bild 29 Bild 30: Die Phosphorwolframsäure aufbringen. Bild 30 Bild 31: 5 Minuten einwirken lassen und die Flasche AD bereit halten. Bild 31 R. Schulte Seite 10

11 Bild 32: Die Phosphorwolframsäure mit AD gründlich abspülen. Bild 32 Bild 33: Die Farbstoffmischung aufbringen und 7 Minuten einwirken lassen. Bild 33 Bild 34: Die Farbstoffmischung aufbringen und 7 Minuten einwirken lassen. Bild 34 Bild 35: Die Farbstoff mit AD abspülen. Bild 35 R. Schulte Seite 11

12 Bild 36: Die Schnitte werden differenziert mit Ethanol 96%. Hier muss schnell gearbeitet werden, weil der Farbstoff sonst zu stark ausgewaschen wird. Meist ist eine Minute genug. Bild 36 Bild 37: Viele Färbungen werden entwässert ab Ethanol 70%, da hier aber bereits mit Ethanol 96% differenziert wurde, kann die nächste Stufe gleich Isopropanol 100% sein. Hier geht kein Farbstoff mehr ab, daher dürfen diese Stufen wieder 4 Minuten lang sein. Zweimal Isopropanol 100%, um sicher zu sein, dass das Wasser auch wirklich komplett entfernt wurde. Bild 37 Bild 38: Nach der zweiten Isopropanol-Stufe wird der OT gründlich vom Isopropanol befreit. Ziel ist, so wenig Isopropanol wie möglich mit in das Xylol zu schleppen. Xylol-Stufen für 4 Minuten, länger ist kein Problem, denn Farbstoff geht nicht mehr ab. Bild 38 Bild 39: Auch jetzt wieder zwei Xylol Stufen. Das Isopropanol muss komplett vertrieben werden durch Xylol, weil die meisten Kunstharze kein Isopropanol und schon gar kein Wasser vertragen. Eine Ausnahme ist Euparal. Es verträgt kein Wasser aber mischt sich mit Isopropanol. Bild 39 R. Schulte Seite 12

13 5. Präparat haltbar machen Zum Einschließen der entwässerten Präparate verwendete man früher Kanadabalsam. Heute sind eine Reihe neutraler, synthetischer Einschlussmittel auf Kunstharzbasis in Gebrauch, die unter verschiedenen Markennamen angeboten werden. Hier wird eingeschlossen mit DePeX. Bild 40: Sofort aus den Xylol-Stufen muss das noch feuchte Präparat eingedeckt werden. Z.B. eine Glas-Pasteurpipette mit angeschmolzener Spitze oder ein Glasstab dienen hierbei als Werkzeug, um einige Tropfen Harz aufzubringen. Bild 40 Bild 41 Bild 42 Deckgläser gibt es in vielen Sorten und Abmessungen (Bild 41 und 42). Wichtig ist, dass sie eine Dicke von 0,17mm haben, da die meisten Objektive hierfür korrigiert sind. Bild 43: Das Auflegen eines Deckglases ist Übungssache. Die Gläser darf man nur am Rand anfassen und schräg auflegen. So wird verhindert, dass störende Luftblasen mit eingeschlossen werden. Bild 43 R. Schulte Seite 13

14 Nachdem das Deckglas drauf ist, muss das Präparat trocknen. Ein Harz wie DePeX ist nach einigen Tagen ausreichend ausgehärtet, sodass man den Harzüberschuss wegschneiden kann. Euparal dauert ungefähr zwei Wochen, Malinol drei bis vier Wochen. Ein völliges Aushärten dauert Monate. Einige Präparate-Mappen aus Pappe sind ein nützliches Zubehör (Bild 44). Bild 44 Später kann das Präparat gesäubert und mit einem Etikett versehen werden (Bild 45). Bild 45 Das Resultat R. Schulte Seite 14